胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非妊娠期糖尿病巨大兒發(fā)生的關(guān)系

丁苗苗，倪麗芳，鄭添，俞秋嫣，王玉環(huán)，楊新軍

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 溫州 325027

巨大兒（macrosomia）是指任何孕周出生體質(zhì)量≥4 000 g的新生兒[1]。近年來，我國巨大兒的發(fā)生率呈上升趨勢，從2006年的6.5%增加到2016年的7.46%[2-3]，部分地區(qū)已達(dá)到9.2%[4]。分娩巨大兒不僅會增加產(chǎn)婦發(fā)生肩難產(chǎn)、產(chǎn)后出血、陰道撕裂等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[5]，還會增加巨大兒成年后罹患肥胖、糖尿病、心血管疾病等的風(fēng)險(xiǎn)[6]。近年來關(guān)于妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）巨大兒的研究較多，且結(jié)論較為一致，而非GDM巨大兒發(fā)生原因和機(jī)制尚不明確。

lncRNA H19是序列長度大于200 nt不編碼蛋白質(zhì)的長鏈非編碼RNA，可通過其第一個(gè)外顯子區(qū)域加工產(chǎn)生的衍生物miR-675發(fā)揮作用，呈胎盤特異性高表達(dá)，是胎盤和胎兒生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控基因[7-8]。lncRNA H19/miR-675可調(diào)節(jié)胎盤生長和滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖[8-9]，但是否參與非GDM巨大兒的發(fā)生發(fā)展仍不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARα）在非GDM巨大兒胎盤中表達(dá)增加[10]，且有研究報(bào)道PPARα可受lncRNA H19/miR-675的靶向調(diào)控[11]，因此本研究假設(shè)胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非GDM巨大兒之間存在一定關(guān)系，通過人群研究和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩個(gè)角度對其進(jìn)行探討。

1 對象和方法

1.1 對象 基于2014—2016年在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院產(chǎn)科建立的孕婦-新生兒隊(duì)列，采用巢氏病例對照研究設(shè)計(jì)，病例組（巨大兒組）為出生體質(zhì)量≥4 000 g的新生兒，對照組為隨機(jī)選擇的出生體質(zhì)量2 500～3 999 g，且與巨大兒分娩時(shí)間相差3 d以內(nèi)的新生兒。入選標(biāo)準(zhǔn)：正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗(yàn)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：有妊娠合并癥者（高血壓、心臟病、肝臟疾病等），有妊娠并發(fā)癥（如胎盤異常、胎膜早破、先兆子癇等），新生兒先天畸形。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有產(chǎn)婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集：采用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查問卷收集產(chǎn)婦和新生兒的基本信息，包括產(chǎn)婦年齡、身高、孕前體質(zhì)量、孕期體質(zhì)量增加、分娩方式，新生兒性別、出生體質(zhì)量及其他相關(guān)信息。

1.2.2 胎盤樣品采集和處理：胎盤娩出后，立即無菌操作取胎盤母體面的滋養(yǎng)層組織1 cm3，放入加有RNAlater（美國Ambion公司）的DEPC處理過的凍存管中，4 ℃保存。采集的樣品液氮運(yùn)輸，并保存于-80 ℃冰箱待檢測分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR-8/SVneo）使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育。細(xì)胞按 lipofectamine 3000說明書的步驟轉(zhuǎn)染。所用的si-H19序列：5’-CCGUCCCUUCUGAAUUUATT-3’，si-NC序 列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-675-mimic 序列：5’-UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG-3’，mimic-NC序列：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’。

1.2.4 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA水平檢測：用TRIzol法提取胎盤及細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達(dá)水平，lncRNA H19、PPARα以GAPDH作為內(nèi)參基因，miR-675以U6作為內(nèi)參基因。所用引物序列l(wèi)ncRNA H19上游：5’-GGACGTGACAAGCA GGACAT-3’，下游：5’-CATAGTGTGCCGACTCCGTG-3’，產(chǎn)物片段長度為148 bp；PPARα上游：5’-CTATCATTTGC TGTGGAGATCG-3’，下游：5’-AAGATATCGTCCGGGTGGT T-3’，產(chǎn)物片段長度為121 bp。GAPDH上游：5’-CAGGA GGCATTGCTGATGAT-3’，下游：5’-GAAGGCTGGGGCTCATT T-3’，產(chǎn)物片段長度為138 bp。miR-675、U6的反轉(zhuǎn)錄和qPCR引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司。qPCR反應(yīng)條件為：95℃ 30s，95℃ 5s，60 ℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot分析：在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24～48 h后提取HTR-8/SVneo細(xì)胞的蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，金屬浴100 ℃、5 min變性蛋白質(zhì)。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，TBST漂洗10 min×3次，PPARα抗體4 ℃搖床孵育過夜，再經(jīng)TBST漂洗10 min×3次，用二抗（1:5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次。用化學(xué)發(fā)光法Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測，蛋白質(zhì)條帶的密度由Quantity One（美國Bio-Rad公司）定量。用GAPDH蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，檢測細(xì)胞總蛋白質(zhì)中PPARα的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料若呈正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以O(shè)R（95%CI）表示各因素對巨大兒發(fā)生的危險(xiǎn)程度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共收集巨大兒55例，對照組58例。兩組間孕前體質(zhì)量、孕前BMI、孕期體質(zhì)量增加、孕周、分娩方式、胎兒性別的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），產(chǎn)婦年齡、身高、初產(chǎn)婦的比例、巨大兒史在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組產(chǎn)婦及新生兒的基線資料比較

2.2 胎盤lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表達(dá)水平 巨大兒組胎盤lncRNA H19和miR-675的表達(dá)量低于對照組，PPARα的表達(dá)量高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[lncRNA H19：0.89（0.63，1.06）vs.0.97 （0.84，1.30），P＜0.01；miR-675：0.79（0.44，1.05）vs.0.98（0.63，1.47），P＜0.05；PPARα：1.45（1.01，1.92）vs.1.06（0.76，1.44），P＜0.01]，見圖1。

圖1 兩組胎盤lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表達(dá)水平比較

2.3 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα表達(dá)與非GDM巨大兒發(fā)生的關(guān)系 考慮潛在影響lncRNA H19、miR-675和PPARα表達(dá)差異的混雜因素，采用多因素logistic回歸分析上述三種基因的胎盤表達(dá)水平與非GDM巨大兒的關(guān)系。在校正孕前BMI、新生兒性別變量后，胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達(dá)仍與非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，即胎盤lncRNA H19和miR-675的低表達(dá)及PPARα高表達(dá)均可增加非GDM巨大兒發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，見表2。

表2 胎盤lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表達(dá)水平與非GDM巨大兒的關(guān)系

2.4 細(xì)胞水平驗(yàn)證lncRNA H19/miR-675對PPARα的調(diào)控作用 在人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR-8/SVneo）中用siRNA敲低lncRNA H19，結(jié)果顯示miR-675表達(dá)下調(diào)，PPARα的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，見圖2A-D。 然而，在HTR-8/SVneo細(xì)胞中敲低lncRNA H19，同時(shí)過表達(dá)miR-675，則PPARα的表達(dá)上調(diào)被抑制，mRNA和蛋白表達(dá)水平與對照組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），見圖2E-H。

3 討論

本研究分析發(fā)現(xiàn)，孕前高BMI和男性新生兒可增加非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與以往的研究[12]結(jié)果一致。此外，在非GDM巨大兒組中孕期體質(zhì)量增加、孕周高于對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明這些也是影響非GDM巨大兒發(fā)生的重要因素。

本研究顯示，在非GDM巨大兒的胎盤組織中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)水平低于對照組，調(diào)整了潛在的混雜因素后，發(fā)現(xiàn)胎盤lncRNA H19低表達(dá)可增加非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，此研究結(jié)果與JIANG等[13]和劉小霄等[14]的報(bào)道一致。lncRNA H19是一種父系印跡、母系表達(dá)的印記基因，具有限制胚胎發(fā)育和減緩子代生長速度的功能[15]，因此當(dāng)胎盤lncRNA H19表達(dá)下調(diào)時(shí)，可導(dǎo)致胚胎過度發(fā)育、加快胎兒的生長速度，從而促進(jìn)巨大兒的發(fā)生發(fā)展。有研究報(bào)道，lncRNA H19是miR-675的主要前體物[16]，它的第一個(gè)外顯子區(qū)域加工后可產(chǎn)生miR-675，且胎盤lncRNA H19可通過核糖核酸結(jié)合蛋白HuR動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)miR-675的加工過程，從而影響miR-675的表達(dá)，也可進(jìn)一步通過miR-675發(fā)揮其生物學(xué)功能[8]。在本研究中，miR-675在非GDM巨大兒的胎盤組織中呈低表達(dá)（與對照組相比），可增加非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，此結(jié)果與lncRNA H19一致，因此，可以認(rèn)為胎盤lncRNA H19/miR-675參與了非GDM巨大兒的發(fā)生發(fā)展。

與對照組比：aP＜0.01圖2 lncRNA H19/miR-675在HTR-8/SVneo細(xì)胞水平可調(diào)控PPARα的表達(dá)

PPARα是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）家族成員之一，在調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸氧化中發(fā)揮重要作用[17]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，非GDM巨大兒胎盤組織中PPARα表達(dá)增加。進(jìn)一步通過TargetScan和MiRanda兩種工具，我們發(fā)現(xiàn)PPARα是miR-675潛在的靶基因。本研究在校正了孕前BMI、新生兒性別等混雜因素后，發(fā)現(xiàn)胎盤PPARα高表達(dá)仍可增加非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且有研究報(bào)道在肝臟和心臟組織中PPARα的表達(dá)可受lncRNA H19/miR-675的靶向負(fù)調(diào)控[11，18]，因此在非GDM巨大兒胎盤組織中PPARα的高表達(dá)可能部分受lncRNA H19/miR-675低表達(dá)的影響。本研究通過構(gòu)建體外細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)在人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR-8/SVneo）中l(wèi)ncRNA H19/miR-675可調(diào)控PPARα的表達(dá)。綜上，胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα通路可能參與了非GDM巨大兒的發(fā)生發(fā)展。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)非GDM巨大兒胎盤中脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（FAT/CD36）和膜脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPpm）等脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白表達(dá)與PPARα一致增 加[19-20]，并與PPARα的表達(dá)水平成正相關(guān)[10]。研究報(bào)道PPARα可通過結(jié)合下游靶基因的PPRE元件從而增強(qiáng)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[21]，但在非GDM巨大兒胎盤中PPARα是否調(diào)控FAT/CD36和FABPpm的表達(dá)并影響了脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)仍然不清楚，其具體機(jī)制以及PPARα在非GDM巨大兒中的臨床意義需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，胎盤lncRNA H19/miR-675表達(dá)下調(diào)，可增加非GDM巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，胎盤PPARα表達(dá)上調(diào)，部分受lncRNA H19/miR-675的調(diào)控，胎盤lncRNA H19/miR-675/PPARα與非GDM巨大兒的發(fā)生存在一定關(guān)系。