納豆菌菌粉復水工藝優(yōu)化研究

◎嚴美婷，張 良

（江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春 336000）

納豆是大豆經納豆菌發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)食品，納豆中含有納豆激酶，其作用廣泛，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能[1-3]。高活力的納豆菌既可以縮短發(fā)酵時間，減少發(fā)酵過程中的污染，減少成本，也能提高納豆激酶酶活性，因此提高納豆菌的發(fā)酵活力至關重要。

納豆菌菌粉相比較于液態(tài)種子液，其明顯優(yōu)勢是污染小，且使用更加便捷。從成本考慮，降低了菌種存放的條件，在低溫干燥的環(huán)境下可保存。但納豆菌菌粉由于經過干燥處理，其細胞及活力都受到了損傷，因此在進行發(fā)酵或繁殖之前，必須對其復水活化，恢復損傷的細胞，經一定時間的培養(yǎng)后恢復其正常的生理功能[4-5]。目前納豆菌的研究主要集中在納豆激酶高產菌株的選育及液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化，以及添加輔佐材料及一些化學藥品對納豆激酶酶活產生的影響，而忽略了納豆菌菌粉的復水活化條件對納豆菌發(fā)酵活力的影響[6]。因此掌握納豆菌菌粉的復水活化機理，選擇合適的復水活化條件對提高納豆菌的發(fā)酵活力至關重要。

本文對納豆菌菌粉的復水活化工藝進行研究，通過單因素和正交試驗優(yōu)化其復水工藝，以期尋找出最佳的納豆菌菌粉復水活化條件，提高其發(fā)酵活力，進而為納豆食品的生產及制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆菌菌粉，江西省食品發(fā)酵研究所微生物實驗室保存；脫脂乳粉，光明脫脂奶粉；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏（分析純），杭州微生物試劑二廠；可溶性淀粉（分析純），廣東汕頭市西隴化工廠。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，瓊脂1.5%～2.5%，NaCl 0.5%，pH 為7.4～7.6。

發(fā)酵液培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%，酵母膏2%，K2HPO40.01%，KH2PO40.01%，CaCl20.05%，pH 為6.5。

1.3 儀器與設備

BXM-30R 立式壓力蒸汽鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、UV-9100 紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）、BS224S 電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）、TGL-16G 臺式離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）、HH-4 恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）及SPH-304 恒溫搖床（上海世平實驗有限公司）。

1.4 單因素實驗

1.4.1 復水劑種類的選擇

以無菌水、生理鹽水、納豆菌培養(yǎng)種子液、黃豆汁以及4%、8%和12%的脫脂乳粉作為復水活化劑，將納豆菌菌粉以1∶200 的比例（W/V）與復水劑混合，置于32 ℃的恒溫箱中復水活化60 min 后用平板菌落計數(shù)法計算活菌數(shù)[7]，再將其接種至發(fā)酵液中進行液態(tài)發(fā)酵[8]，用福林酚法[9]測定發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水劑種類。

1.4.2 菌粉與復水劑比例的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑分別按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300 和1∶350 的比例混合，置于32 ℃恒溫箱中復水活化60 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的比例。

1.4.3 復水時間的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后置于32 ℃恒溫箱中分別復水活化20 min、40 min、60 min、80 min、100 min 和120 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水時間。

1.4.4 復水溫度的選擇

將納豆菌菌粉與復水劑以1∶200 的比例（W/V）混合后分別置于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃和44 ℃的恒溫箱中復水活化60 min，測定活菌數(shù)及發(fā)酵液中納豆激酶酶活，從而確定最佳的復水溫度。

1.5 正交優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結果，分別選取納豆菌菌粉與復水劑比例（A）、復水溫度（B）和復水時間（C）3 個因素進行正交優(yōu)化實驗。其正交實驗水平因素設計見表1。

表1 正交實驗水平因素設計表

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 復水劑種類對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖1 可知，不同的復水劑對納豆菌菌粉復水活化的效果不同，無菌水對菌粉的復水活化效果最差，以8%脫脂乳和12%脫脂乳作為復水劑時效果最好，菌粉復水活化后活菌數(shù)及納豆激酶酶活較高，其中兩者的活菌數(shù)相差較小，而以8%脫脂乳為復水劑時納豆激酶酶活高于12%脫脂乳復水劑，故選擇8%脫脂乳粉作為最佳復水劑。

圖1 復水劑種類對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.2 菌粉與復水劑的比例對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖2 可知，活菌數(shù)隨菌粉與復水劑比例升高呈下降趨勢，這是由于隨著復水劑含量的增加，菌粉的含量相對減少所導致。而納豆激酶酶活呈先增加后下降趨勢，當比例為1∶100 時酶活最高，為629.325 U·mL-1，這說明在此比例下復水劑對菌粉的復水效果最好，復水活化后納豆菌的活力最強。故綜合數(shù)據(jù)分析，選擇該比例前后接近的梯度1∶75、1∶100、1∶125 作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖2 菌粉與復水劑的比例對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.3 復水溫度對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖3 可知，活菌數(shù)和納豆激酶酶活隨著復水溫度的升高都呈先升高后降低的趨勢，納豆菌菌粉在36 ℃條件下復水后活菌數(shù)最高，在40 ℃條件下復水活化后納豆激酶酶活最高，但此溫度下的活菌數(shù)與36 ℃條件下的活菌數(shù)相差不大，因此綜合考慮選擇32 ℃、36 ℃、40 ℃作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖3 復水溫度對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.1.4 復水時間對納豆菌菌粉復水活化的影響

由圖4 看出，從20～60 min 這段時間納豆菌活菌數(shù)和納豆激酶酶活增加明顯，當菌粉復水60 min后其活菌數(shù)和納豆激酶酶活達到最高，活菌數(shù)達5.051×108CFU·mL-1，發(fā)酵后酶活達587.924 U·mL-1。繼續(xù)增加復水時間，活菌數(shù)和納豆激酶酶活都下降，說明復水時間過長，反而對納豆菌菌粉活化不利。綜上分析，選擇以60 min 為基準上下10 min 為梯度的3 個水平：50 min、60 min、70 min 作為該因素3 個水平進行正交實驗。

圖4 復水時間對納豆菌菌粉復水活化的影響圖

2.2 正交優(yōu)化實驗結果

對正交實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，正交實驗結果見表2，方差分析見表3。由表2 可知，Rc＞RA＞RB，則表明各因素對實驗影響大小為C ＞A ＞B，由表3可知菌粉與復水劑比例和復水時間對納豆激酶酶活的影響顯著（P＜0.05），復水溫度對酶活的影響不顯著（P＞0.05）。由表4 可知，A2與A3差異不顯著，與A1差異顯著，較佳水平為A2（k2最大），B 因素的各水平對納豆激酶酶活力的影響無差異，但較佳水平為B2，C2與C3、C1間差異顯著，較佳水平為C2，故納豆菌菌粉的最佳復水工藝方案為A2B2C2。經實驗驗證得出采用此工藝納豆菌菌粉復水活化后活菌數(shù)達5.268×108CFU·mL-1，納豆激酶酶活達750.062 U·mL-1，因此納豆菌菌粉的最佳復水工藝為：以8%的脫脂乳粉作為復水活化劑，發(fā)酵劑與復水劑比例為1∶100，復水溫度為36 ℃，復水時間為60 min。

表2 正交試驗結果表

表3 方差分析結果表

表4 多重比較結果表

3 結論

納豆菌菌粉在用于發(fā)酵納豆前需進行復水活化，恢復細胞的正常功能。本文采用單因素及正交實驗對納豆菌菌粉的復水活化工藝進行了優(yōu)化，確定了菌粉最佳復水活化工藝為：以8%脫脂乳粉為復水劑，發(fā)酵劑與復水劑比例為1∶100，復水溫度為36 ℃，復水時間為60 min，在此條件下納豆菌菌粉經復水活化后活菌數(shù)達到了5.268×108CFU·mL-1，用于液態(tài)發(fā)酵時納豆激酶酶活達750.062 U·mL-1。

此復水工藝有效地提高了納豆菌菌粉的活性，從而有利于提高納豆及其制品的生產效率及其穩(wěn)定性。