高效液相色譜法測定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸及(R, S)-告依春的含量

皇甫通，馮清強，周家平，馬成俊，毛瑞華，楊 磊，李 巖，王振華*

(1.煙臺大學生命科學學院，煙臺264005；2.煙臺海研制藥有限公司，煙臺264005)

新獸藥蒿板青顆粒的原處方為人用藥復方一枝蒿顆粒，其收載于《國家中成藥標準匯編》內科肺系(一)分冊(WS-10018(ZD-0018)-2002)，具有解表祛風，涼血解毒，用于邪毒所致的感冒發(fā)燒，咽喉腫痛，病毒性感冒的治療。該處方在常用中藥復方板藍根顆粒(成分：板藍根、大青葉)的基礎上，加入具有清熱解毒的維藥新疆一枝蒿組方，板藍根、大青葉與新疆一枝蒿的生藥比例為1∶1∶1，經過水提醇沉、濃縮、加工制粒而成[1]，體外活性研究及多年臨床應用表明，和復方板藍根顆粒相比該藥物在抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調節(jié)等方面顯示出更為優(yōu)良的療效[2-6]。獸藥板青顆粒收載于《中國獸藥典》2015版二部，由板藍根和大青葉兩味中藥材經水煎煮、濾過和濃縮、加工制粒而成，具有清熱解毒、涼血功效，廣泛用于畜禽風熱感冒、咽喉腫痛、熱病發(fā)斑等溫熱性疾病防治。鑒于此，我們在多年生產使用獸藥板青顆粒的基礎上，對人用藥復方一枝蒿顆粒的生產工藝和針對畜禽風熱感冒初步藥效學進行了系統(tǒng)研究，比較其相對于板青顆粒的優(yōu)勢，決定將其開發(fā)為用于防治獸禽溫熱性疾病的藥物，命名為“蒿板青顆?！?，現(xiàn)已完成臨床前及臨床研究。人用藥“復方一枝蒿顆?！薄ⅰ皬头桨逅{根顆?！焙汀矮F藥板青顆?！辟|量標準中均無有效物質定量控制方法，實驗針對蒿板青顆粒制備工藝特點及獸藥質量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物質一枝蒿酮酸和板藍根中的有效物質(R, S)-告依春為指標成分，研究建立了高效液相色譜法同時測定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并根據(jù)《獸藥質量標準分析方法驗證指導原則》的要求[7]，對上述方法進行了驗證，為蒿板青顆粒的質量控制提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 一枝蒿酮酸對照品，批號：20190522，中國科學院新疆理化技術研究所；(R,S)-告依春對照品，批號：111753-201706，中國食品藥品檢定研究院；三批蒿板青顆粒中試樣品(批號：190201、190202、190203)，煙臺海研制藥有限公司提供；不含新疆一枝蒿及板藍根的陰性對照樣品(自制)；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，均購于國藥集團化學試劑有限公司，水為超純水(自制)。

1.2 儀器 Sartorius十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；Agilent 1260四元高效液相色譜儀配1260 UV檢測器(美國Agilent公司)；DSA300-SK1-12L型超聲波清洗機(福州仟度電子儀器有限公司)。全波長紫外掃描儀uv-9000(上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的選擇 以甲醇做為溶劑，將一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春對照品分別制成10 μg/mL的溶液，在200～400 nm波長范圍下掃描，結果見圖1。一枝蒿酮酸的λmax=245 nm；(R, S)-告依春的λmax=243 nm，參考文獻資料[9-13]，確定245 nm做為高效液相色譜的檢測波長。

圖1 一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的紫外光譜圖Fig 1 UV spectra of Rupestonic acid and (R, S)-epigoitrin

表1 含量測定梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution condition for content determination

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液制備 取一枝蒿酮酸對照品約30 mg，(R, S)-告依春對照品約6 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含有120 μg /mL(R, S)-告依春與600 μg /mL一枝蒿酮酸對照品混合儲備液；精密量取對照品混合儲備液1.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為7.2 μg /mL(R, S)-告依春與36 μg /mL一枝蒿酮酸的對照品混合溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 取蒿板青顆粒(批號：190201)，研磨成粉，取約6 g細粉，精密稱定，置于100 mL具塞容量瓶中，精密量取50 mL 80%甲醇，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足損失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取濾過液，即得。

2.3.3 陰性對照溶液制備 按照處方量及制備工藝，分別制備輔料、不含新疆一枝蒿、不含板藍根的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備空白溶液和陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗 分別量取空白溶液、一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春對照品混合溶液、蒿板青顆粒溶液和陰性對照溶液，按 2.2項色譜條件測定，結果見圖2。在該色譜條件下，一枝蒿酮酸的保留時間在36 min 左右，(R, S)-告依春的保留時間在9 min左右，分離度達到1.5以上，理論塔板數(shù)大于3000，陰性樣品在此時間附近無吸收峰。結果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測要求；處方中其它成分對一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春定量檢測無干擾，說明該方法能滿足檢測要求。

(A)空白溶液(輔料)；(B)混合對照；(C)陰性樣品(缺板藍根);(D)陰性樣品(缺新疆一枝蒿);(E)蒿板青顆粒；a. (R, S)-告依春；b. 一枝蒿酮酸(A)Blank solution;(B)Control；(C)Negative sample (Lack Radix Isatis tinctoria Fort.)(D)Negative sample (Lack Artemisia rupestris L．);(E)Haobanqing granules； a. (R, S)-epigoitrin; b. Rupestonic acid圖2 樣品中(R,S)- 告依春與一枝蒿酮酸高效液相圖Fig 2 HPLC chromatogram of (R, S)-epigoitrin and Rupestonic acid in sample

2.5 線性關系考察 精密量取混合儲備液1、1.5、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，一枝蒿酮酸的濃度分別為：24、36、48、72、96、120 μg /mL；(R,S)-告依春的濃度分別為4.8、7.2、9.6、14.4、19.2、24 μg /mL。按照2.2項下的色譜條件分別進樣，測定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，作線性回歸，一枝蒿酮酸的回歸方程為y= 57.667x-120.680，R2=0.9992；(R,S)-告依春的回歸方程為y= 152.340x-274.890，R2=0.9997。一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 取線性試驗項下的混合貯備液(一枝蒿酮酸的濃度為600 μg /mL，(R, S)-告依春的濃度為120 μg /mL)3 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按 2.2 項下的色譜條件重復測樣6次，測定峰面積，結果顯示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春相對標準偏差RSD分別1.72%、1.50%，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液(批號190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 測定，根據(jù)峰面積值，分別計算樣品中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量變化。結果顯示，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的平均含量分別為226.57和31.49 μg/g，RSD分別為1.38%和1.63%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取供試品溶液6份(批號190201)，制備成6份適宜濃度的供試品溶液，按照2.2項下的色譜條件測定各自一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量。結果顯示，6份同一批次樣品中一枝蒿酮酸的平均含量為 226.32 μg/g，RSD為1.25%；(R, S)-告依春的平均含量為32.27 μg/g，RSD為2.08%，表明該方法有良好的重現(xiàn)性。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的板青蒿顆粒(批號190201)樣品約6.0 g，共15份，置于100 mL容量瓶中，平均分為5組，每組分別精密加入濃度為600 μg /mL的一枝蒿酮酸對照品溶液1.8、2.25、2.7 mL和濃度為120 μg /mL的(R, S)-告依春對照品溶液1.42、1.13、1.7 mL，用80%甲醇溶解并定容至刻度，密塞，精確稱定重量，超聲30 min，放冷，稱定重量，用80%甲醇補足損失的重量，搖勻，微孔濾膜濾過。取濾液，按照2.2項下的色譜條件，各取20 μL注入色譜儀進行測定，記錄色譜峰面積，計算加樣回收率，結果見表2。由實驗結果得知，3組樣品中一枝蒿酮酸的平均加樣回收率分別為98.4%、97.9%和98.1%，RSD分別為1.31%、1.02%和1.33%；3組樣品中(R,S)-告依春的平均加樣回收率分別為98.8%、98.3%和97.5%，RSD分別為0.56%、0.88%和1.14%，均符合相關要求。

表2 加樣回收率(n=5)Tab 2 Recovery test data sheet

2.10 耐用性

2.10.1 不同色譜柱耐用性試驗 取供試品溶液(批號190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項下的色譜條件，分別用SUPELCO ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Prodigy ODS-3V C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Thermo Scientific ODS C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm) 三個不同廠家的色譜柱，每個色譜柱進樣2次，測定一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的含量，結果見表3。同一供試品在更換不同色譜柱下進行測定，一枝蒿酮酸的RSD為0.90%；(R, S)-告依春的RSD為1.27%。結果表明該方法對不同廠家的色譜柱耐用性良好。

表3 不同色譜柱耐用性試驗Tab 3 Serviceability test of different chromatographic column

2.10.2 不同分析人員耐受性試驗 取供試品溶液(批號190201)，制備成適宜濃度，按照2.2項下的色譜條件，由實驗室3位分析人員每人制備1份供試品溶液，在同一色譜儀上各自操作測定自己制備樣品中一枝蒿酮酸和(R,S)-告依春的含量，每人進樣2次，記錄峰面積，計算6次測定含量變化，結果見表4。3人6次測定同一樣品的一枝蒿酮酸RSD為0.85%；(R,S)-告依春的RSD為1.43%，表明該方法在不同分析人員間的耐受性良好。

表4 不同分析人員的耐受性實驗Tab 4 Serviceability test of different analysts

2.11 樣品檢測 取三批中試樣品(批號190201、190202、190203)，按以上確定的高效液相色譜法，每批次取樣兩份進行測定，計算平均含量，結果見表5。通過對3批次中試樣品含量分析，一枝蒿酮酸的含量在224.66～229.28 μg/g之間；(R, S)-告依春的含量在30.95～33.40 μg/g之間，因此將蒿板青顆粒的質量標準含量限量暫定為：一枝蒿酮酸的含量不得低于220 μg/g；(R, S)-告依春的含量不得低于30 μg/g，待以后通過對多批次的樣品分析后，再科學地確定其限量。

表5 樣品含量測定Tab 5 Content determination results of 3 batches of samples

3 討論與結論

3.1 含量測定方法的選擇 蒿板青顆粒的原處方為人用藥復方一枝蒿顆粒，而復方一枝蒿顆粒是在常用中藥復方板藍根顆粒(成分：板藍根、大青葉)的基礎上，加入具有清熱解毒的維藥新疆一枝蒿組方，經過水提醇沉、濃縮、加工制粒而成，該標準沒有有效物質含量測定方法?，F(xiàn)有研究資料表明，新疆一枝蒿中含有黃酮類、倍半萜類、苷類、揮發(fā)油、生物堿等，其中一枝蒿酮酸是主要有效成分，具有顯著的抗炎、抗病毒活性[9]。大青葉中的主要活性成分有靛藍、靛玉紅等；板藍根中的主要活性成分有靛藍、靛玉紅及核苷類成分，這些成分具有抗病毒、消炎抑菌、抗氧化等藥理活性[10]。已有報道采用高效液相色譜法測定新疆一枝蒿、復方一枝蒿制劑中有效物質一枝蒿酮酸、大青葉中的有效成分靛玉紅和板藍根中的有效物質(R, S)-告依春[11-14]。2017版《獸藥質量標準瘙簚中藥卷》中板藍根注射液含量測定指標成分為(R, S)-告依春。我們前期藥學研究表明，大青葉、板藍根中的靛藍、靛玉紅在藥材和制劑提取、制備及貯藏過程中穩(wěn)定性差，不適合做為指標成分控制質量，本實驗針對蒿板青顆粒制備工藝特點及獸藥質量控制要求，以新疆一枝蒿的有效物質一枝蒿酮酸和板藍根中的有效物質(R, S)-告依春為指標成分，研究建立了高效液相色譜法同時測定蒿板青顆粒中一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春的方法，并對測定方法進行了系統(tǒng)的考察，結果表明該方法操作簡便，一枝蒿酮酸在24～120 μg/mL范圍內；(R, S)-告依春在4.8～24 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，方法準確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達到檢測要求。

3.2 樣品前處理方法的選擇 試驗表明，一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春告依春易溶于甲醇，我們采用不同濃度的甲醇溶液超聲提取，并考察了超聲時間和提取次數(shù)，結果顯示以80%甲醇溶液超聲提取30 min，可以將樣品中的一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春提取完全。

3.3 流動相的優(yōu)選 本處方由三味藥材組成，所含成分復雜，待測指標成分一枝蒿酮酸和(R, S)-告依春化學結構和極性存在巨大差異。經采用不同比例的甲醇：0.4%磷酸水溶液和乙腈：0.4%磷酸酸水溶液等度洗脫，均不能實現(xiàn)待測物質和雜質的有效分離，峰型對稱性差，檢測時間過長，并且以甲醇：0.4%磷酸水溶液洗脫，一枝蒿酮酸色譜峰拖尾明顯。為此，以乙腈：0.4%磷酸為洗脫劑，采用二元高效液相色譜，對線性洗脫條件進行了優(yōu)選，最終選擇的方法為：流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 min，5% A；0～10 min，5% A→15% A；10～25 min，15% A→30% A；25～40 min，30% A；40～41 min，30% A→5% A；41～45 min，5% A)，檢測波長245 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫35 ℃。在該色譜條件下，(R, S)-告依春的保留時間在9 min左右，一枝蒿酮酸的保留時間在36 min 左右，理論塔板數(shù)均大于3000，陰性樣品對應時間附近無吸收峰，待測物質和雜質間得到很好分離。

研究建立的高效液相色譜法測定新獸藥蒿板青顆粒中有效物質一枝蒿酮酸與(R, S)-告依春含量的方法，結果表明，該方法操作簡便，重復性好，準確度高，為進一步控制新藥蒿板青顆粒的質量提供了理論依據(jù)。