大鼠脊髓撞擊損傷模型的建立和鑒定

林 翔，劉蔚楠，林家鐘，王榮茂

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是常見的嚴 重的中樞神經(jīng)損傷性疾病，常致患者截癱，嚴重影響患者身心健康，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。穩(wěn)定、可靠的脊髓損傷模型是研究脊髓損傷機制及治療方法的前提，本研究旨在Allen′s法造模原理基礎(chǔ)上設(shè)計出一種經(jīng)濟、操作簡單、穩(wěn)定性高、臨床相似度好、易于推廣的脊髓撞擊損傷模型，為脊髓損傷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年健康清潔級SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量300 g左右，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［許可證號：SCXK（滬）2007-0005］。

1.1.2 儀器與試劑 生物顯微鏡（Olympus，Japan），體式顯微鏡（Olympus，Japan），數(shù)碼相機（Olympus，Japan），肌電圖－誘發(fā)電位記錄儀（Nicolet-Viking膝上型），自制脊髓損傷打擊器（圖1，主要由套管及30 g克氏針組成），10%水合氯醛，4%多聚甲醛，0.5%伊紅液，蘇木素染色液，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，無水乙醇，二甲苯。

1.2 實驗方法

脊髓撞擊損傷模型建立：SD大鼠32只，按隨機數(shù)字法隨機分為A、B、C、D 4組，每組8只。以10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺板上，背部剃毛，常規(guī)消毒鋪巾。以與最低位肋骨相連的椎骨（T12）作為定位標志，以T10棘突為中心作長約3 cm的后正中切口，暴露T9-11棘突及椎板，切除T10椎板，充分暴露脊髓T10段。將1 mm厚小墊片貼附在硬脊膜上，用30 g克氏針沿套管從不同高度自由墜落（A組墜落高度為1.5 cm，B組墜落高度為2.0 cm，C組墜落高度為2.5 cm，D組墜落高度為3.0 cm，撞擊沖量=質(zhì)量×高度），垂直打擊直接造成脊髓損傷，撞擊脊髓后克氏針在脊髓表面停留5 s。如局部脊髓迅速水腫、瘀血，大鼠全身迅速回縮樣抖動，提示撞擊模型成功。關(guān)閉切口，大鼠單籠飼養(yǎng)，用青霉素4×104U/d抗感染，連用3 d。

1.3 檢測指標

1.3.1 組織學(xué)觀察 術(shù)后14 d所有實驗大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，沿胸骨柄剪開胸腔，暴露心臟，將灌注針頭插入主動脈，快速用生理鹽水沖洗血液后，再用4%多聚甲醛灌流固定1.5 h。以損傷區(qū)域為中心切取約1 cm長的脊髓組織，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定2 h后常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)橫向切片，行HE染色顯微鏡下觀察脊髓損傷區(qū)域結(jié)構(gòu)。

1.3.2 行為學(xué)觀察 各組大鼠在造模前1 d，造模后1 d、3 d、7 d、14 d按Tarlov評分標準行神經(jīng)功能評定。以0～2分為截癱，采用雙人雙盲獨立評分后取平均值。

1.3.3 神經(jīng)電生理檢測 體感誘發(fā)電位（SEP）：刺激電極置于大鼠正中神經(jīng)和脛后神經(jīng)處，參考電極插入額部皮下，記錄電極插入兩耳連線中點［1-2］。刺激參數(shù)：強度2.0 mA、時程20 ms、頻率3.43 Hz、疊加次數(shù)300次。記錄各組大鼠損傷前、損傷后1 d、3 d、7 d及14 d體感誘發(fā)電位潛伏期及波幅的變化。運動誘發(fā)電位（MEP）：刺激電極置于大鼠顱頂冠狀縫前2 mm，矢狀縫旁2 mm皮下，記錄電極插入肱三頭肌和腓腸肌腹中部［1-2］。強度30 V，串?dāng)?shù)5個。記錄各組大鼠損傷前、損傷后1 d、3 d、7 d及14 d運動誘發(fā)電位潛伏期及波幅的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗。P〈0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 簡易打擊器的制作和應(yīng)用

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓撞擊損傷組織HE染色

A組：神經(jīng)元細胞呈三角形，尼氏體分散在胞質(zhì)中，膠質(zhì)細胞輪廓清楚，神經(jīng)纖維排列整齊、緊密。B組：神經(jīng)元細胞減少，但輪廓仍清楚，神經(jīng)纖維排列稀疏，結(jié)構(gòu)尚清。C組：神經(jīng)元細胞稀少，輪廓欠清，可見空泡樣變性，神經(jīng)纖維排列欠清。D組：神經(jīng)元細胞更稀少，輪廓欠清，空泡樣變性增多，神經(jīng)纖維排列不清。結(jié)果見圖2。

圖2 脊髓組織HE染色（×100）

2.2 大鼠脊髓撞擊損傷Tarlov評分

A組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d較造模前1 d降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05），造模后7 d、14 d與造模前1 d比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）；B組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d、7 d較造模前1 d降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05），造模后14 d與造模前1 d比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P〉0.05）；C組及D組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d、7 d、14 d均較造模前1 d降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P〈0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠不同觀測點Tarlov評分比較 ，±s（分 ）

表1 各組大鼠不同觀測點Tarlov評分比較 ，±s（分 ）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05

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2.3 各組大鼠不同觀測點截癱例數(shù)比較

A組及B組造模后1 d分別有4只及7只大鼠截癱，造模后7 d無大鼠截癱；C組造模后1 d所有大鼠截癱，造模后14 d仍有5只大鼠截癱（P〈0.05）；D組造模后1 d大鼠均截癱，造模后14 d仍截癱。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠不同觀測點截癱例數(shù)比較 （例）

2.4 大鼠脊髓撞擊損傷神經(jīng)電生理檢測

造模后電生理檢測中SEP、MEP潛伏期和波幅較造模前均有不同程度的改變，按A組至D組改變程度依次加大（P〈0.05）。A組大鼠在造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅恢復(fù)至造模前水平；B組和C組造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅均不能恢復(fù)至造模前水平（P〈0.05），且C組較B組恢復(fù)差（P〈0.05）。D組大鼠造模后各觀察點SEP、MEP潛伏期和波幅數(shù)值均為0。結(jié)果見表3～表6。

表3 各組大鼠不同觀測點SEP潛伏期測量結(jié)果比較（m s，±s）

表3 各組大鼠不同觀測點SEP潛伏期測量結(jié)果比較（m s，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表4 各組大鼠不同觀測點SEP波幅測量結(jié)果比較 （m V，±s）

表4 各組大鼠不同觀測點SEP波幅測量結(jié)果比較 （m V，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表5 各組大鼠不同觀測點MEP潛伏期測量結(jié)果比較 （m s，±s）

表5 各組大鼠不同觀測點MEP潛伏期測量結(jié)果比較 （m s，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表6 各組大鼠不同觀測點MEP波幅測量結(jié)果比較 （m V，±s）

表6 各組大鼠不同觀測點MEP波幅測量結(jié)果比較 （m V，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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3 討論

Allen AR在1911年創(chuàng)造了通過垂直打擊脊髓制備脊髓損傷模型的方法。該法以一定力量撞擊脊髓后造成脊髓缺血、水腫及繼發(fā)的一系列反應(yīng)，比較接近人類脊髓損傷的病理、生理及變化規(guī)律，臨床相關(guān)性好［3-6］。由于根據(jù)Allen′s法原理研制出的標準打擊器價格昂貴，在國內(nèi)未能普及。本實驗基于經(jīng)典Allen′s法原理制作簡易打擊器，并對使用該打擊器所制作的大鼠脊髓損傷模型進行評價。

簡易打擊器的制作及使用方法：1 mL醫(yī)用注射器的內(nèi)徑為4.0 mm，將注射器頭端剪開制作成一個套管，在套管外側(cè)粘醫(yī)用膠布并標記刻度，起始刻度位于注射器尾端。測量直徑4.0 mm克氏針的總質(zhì)量和總長度，截取質(zhì)量為30 g的克氏針作為撞針。暴露好脊髓后將1 mm厚小墊片貼附在硬脊膜上，注射器套管的尾端垂直放在小墊片上（注射器尾端的翼有利于垂直放置套管）?？耸厢橅樦坠軓牟煌叨却怪贝驌艏顾瑁瑥亩瓿杉顾璐驌魮p傷模型的制作。

國內(nèi)文獻報道大鼠脊髓打擊損傷模型研究中的打擊沖量多集中在20～100 g/cm［7-8］。因大鼠脊髓輕度損傷時具有較強的自愈性［9-10］，不利于觀察實驗干預(yù)情況，故本研究選取的打擊沖量為45～90 g/cm。本研究大鼠脊髓HE染色顯示隨著打擊沖量增加，組織學(xué)損傷程度加重：A組大鼠脊髓神經(jīng)元細胞未見明顯減少、皺縮，神經(jīng)纖維排列整齊；B組大鼠脊髓神經(jīng)元細胞減少，神經(jīng)纖維排列稀疏。C組大鼠脊髓神經(jīng)元細胞稀少，可見空泡樣變性，神經(jīng)纖維排列欠清。D組大鼠脊髓神經(jīng)元細胞較C組更稀少，輪廓欠清，空泡增多，神經(jīng)纖維排列不清。本實驗各組大鼠脊髓打擊損傷后均出現(xiàn)Tarlov評分下降，A組及B組大鼠造模后不能達到100%的截癱率，造模后Tarlov評分逐漸恢復(fù)，造模后7 d接近術(shù)前水平。C組大鼠造模后截癱率為100%，造模后Tarlov評分逐漸恢復(fù)，但造模后14 d仍恢復(fù)不到術(shù)前水平。D組大鼠脊髓打擊損傷后造成所有大鼠完全性癱瘓，造模后14 d仍無恢復(fù)。造模后除D組外電生理檢測中SEP、MEP潛伏期和波幅較造模前均有不同程度的改變，按A組至C組改變程度依次加大，A組大鼠在造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅恢復(fù)至造模前水平；B組和C組造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅不能恢復(fù)至造模前水平，且C組較B組恢復(fù)差。D組大鼠造模后各觀測點SEP、MEP潛伏期和波幅均無反應(yīng)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組和B組能夠造成部分大鼠截癱，但在無治療干預(yù)情況下大鼠脊髓損傷可較好恢復(fù)，所以不利于觀察各種治療方法對大鼠脊髓損傷的干預(yù)效果；D組能夠造成所有大鼠截癱，但造模后各觀測點大鼠脊髓損傷無任何恢復(fù)跡象，脊髓損傷可能為不可逆損傷，故各種治療方法的干預(yù)可能對該組大鼠脊髓損傷恢復(fù)無效或者療效不顯著，不利于實驗觀察；C組采用75 g/cm打擊沖量造模能夠造成所有大鼠截癱，且造模后大鼠脊髓損傷有一定程度恢復(fù)，具有可逆性，更有利于觀察各種治療方法對大鼠脊髓損傷恢復(fù)的干預(yù)效果，故我們認為采用該方法制作大鼠脊髓損傷模型的打擊沖量選75 g/cm較為合適。

本研究采用簡易打擊器制作大鼠脊髓損傷模型（打擊沖量為75 g/cm）可造成所有大鼠截癱，模型可重復(fù)性高。其脊髓病理學(xué)表現(xiàn)、神經(jīng)行為學(xué)評分及神經(jīng)電生理檢測表明這種脊髓損傷具有可逆性，可作為理想的脊髓打擊傷治療研究的動物模型。