細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)敲除和人源化小鼠模型的建立

黃藝瀅,張文龍,石桂英,雷雪裴,高苒,白琳

(國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic Tlymphocyte associated protein 4,CTLA4)和CD28是表達(dá)在CD4+和CD8+T細(xì)胞的同源受體,兩者共享在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)的一對(duì)配體,并且在T細(xì)胞活化中介導(dǎo)相反的功能。配體與CD28相互作用,介導(dǎo)T細(xì)胞與T細(xì)胞受體信號(hào)共刺激。而配體與CTLA4的相互作用可以介導(dǎo)T細(xì)胞功能的抑制[1]。目前,癌癥免疫療法已成為治療癌癥的有效方法,CTLA4是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的免疫檢查點(diǎn)的靶標(biāo)之一[2]。由于CTLA4功能的重要性,在許多臨床前和臨床研究中都對(duì)anti-CTLA4抗體[3]及CTLA4阻滯劑[4-10]進(jìn)行了癌癥治療的測(cè)試。人類和小鼠的CTLA4只具有75.16%的同源性,目前批準(zhǔn)用于臨床的anti-CTLA4抗體可以與人源CTLA4結(jié)合,但不會(huì)與鼠源CTLA4交叉反應(yīng)[11]。因此,在利用小鼠進(jìn)行藥物有效性和安全性評(píng)價(jià)時(shí),使用CTLA4人源化的小鼠是更好的選擇。

采用CRISPR/Cas9的方法將人源CTLA4基因?qū)氲叫∈蟮氖芫阎?同時(shí)敲除小鼠內(nèi)源CTLA4基因的表達(dá)。CTLA4敲除小鼠在出生后3～5周內(nèi)死亡,而CTLA4人源化小鼠表型正常。通過(guò)建立基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)方式與人類相似的模型,改善由于CTLA4在人與小鼠中的種屬差異導(dǎo)致的在臨床測(cè)試與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異,從而使藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果更加客觀。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J(雌性,3～4周齡,7～12 g,15只;雄性,8周齡,19～25 g,30只)及ICR小鼠(雌性,8～10周齡,25～33 g,4只),購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2020-0004】并在本所SPF級(jí)動(dòng)物屏障環(huán)境動(dòng)物房【SYXK(京)2019-0014】中長(zhǎng)期飼養(yǎng)繁殖。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～26℃,濕度40%～70%,光照周期明暗比12 h:12 h。飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食飲水,墊料、鼠盒、水瓶、均經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理。涉及動(dòng)物操作程序和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為BL18003。

1.1.2 主要試劑與儀器

載體構(gòu)建:試劑盒 MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit(Ambion,Am1354);試劑盒mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit(Ambion,Am1345)?；蛐丸b定:EasyPure?Genomic DNA Kit(Transgen,EE101-12);鼠尾直接PCR試劑盒(Bimake,B45012)。蛋白免疫印跡:RIPA裂解液(碧云天,P0013B);一抗稀釋液(碧云天,P0256);PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)(雅酶,PG113)一抗:CTLA4(Abcam,ab134090),βactin(Bioss,bs-0061R);二抗:山羊抗兔(中杉金橋,ZB-5301)。細(xì)胞培養(yǎng):MEM培養(yǎng)基(Gibco,12571063);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco,11875093);胎牛血清(Gibco,10099141C)青鏈霉素(Gibco,15140122),CD3抗體(Santa,sc-20047)。RT-PCR:TRIzol(Invitrogen,15596018);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,K1682)。流式細(xì)胞術(shù):紅細(xì)胞裂解液(BD,555899);抗體:CD4-FITC、B220-PE-Cy7、CD8-APC、CD11b-APC-Cy7、NK1.1-SB436、CD3-SB702(Invitrogen)。

多樣品研磨珠均質(zhì)儀(OMNI,Bead Ruptor 24 Elite),電泳儀(Bio-Rad),PCR儀(Hema),細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo),流式細(xì)胞儀(BD FACSAria),組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

(1)sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建:小鼠CTLA4基因位于第一號(hào)染色體的1C2區(qū)段(ENSMUSG00000026011)。針對(duì)該基因,設(shè)計(jì)并合成一對(duì)向?qū)NA(single-guide RNA,sgRNA)作用靶點(diǎn)(上海英濰捷基),分別為靶點(diǎn)1:GGGTTCAAACACATCTCAAGG(寡核苷酸序列為:m-CTLA4-gRNA UP1∶5’-TAGGGGGTTCAAACAC ATCTCA-3’和 m-CTLA4-gRNA DOWN1∶5’-AAACTGAGATGTGTTTGAACCC-3’)和 靶 點(diǎn) 2:GAGACTTCTGGAACATGGAGG(寡核苷酸序列為:m-CTLA4-gRNA UP2:5’-TAGGGAGACTTCTGGAACA TGG-3’和m-CTLA4-gRNA DOWN2∶5’-AAACCCATG TTCCAGAAGTCTC-3’)。對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將合成的CTLA4 sgRNA單鏈通過(guò)退火復(fù)性結(jié)合成小片段。用Bsa I酶切pUC57-sgRNA表達(dá)載體使其線性化,然后與CTLA4 sgRNA雙鏈進(jìn)行連接。構(gòu)建完成的 sgRNA載體利用試劑盒MEGAshortscriptTMT7 Transcription Kit,通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄為sgRNA。

(2)CAS9載體構(gòu)建:pST1374-NLS-flag-linker-Cas9載體利用試劑盒mMESSAGE mMACHINETMT7 ULTRA Transcription Kit通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄成為Cas9-RNA。

1.2.2 顯微注射

將轉(zhuǎn)錄后的sgRNA與Cas9-RNA混合,并將終濃度調(diào)整為每種sgRNA 20 ng/μL與10 ng/μL。用顯微注射法注射于C57小鼠受精卵中,用ICR雌鼠作為假孕受體,將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部,等待小鼠出生。

1.2.3 基因型鑒定

小鼠出生后進(jìn)行編號(hào),并取尾尖進(jìn)行鑒定。使用Genomic DNA Kit提取基因組DNA,根據(jù)序列信息分別設(shè)計(jì)2對(duì)人源化及1對(duì)敲除檢測(cè)引物(上海英濰捷基),2對(duì)人源化檢測(cè)引物分別為:M-CTLA4-UP-S:5’-CTACCACTGAGCTACATCTATACCTCTGAG-3’,M-CTLA4-UP-A:5’-GCCACGTGCATTGCTTTG-3’(產(chǎn) 物 1098 bp)和 M-CTLA4-DOWM-S:5’-GGAACCCAGATTTATGTAATTGATCC-3’,M-CTLA4-DOWM-A:5’-TTATTGGATAGTCAGCTGGTGTGC-3’產(chǎn)物(1254 bp),可以分別檢測(cè)轉(zhuǎn)入人源CTLA4基因的上游和下游;1對(duì)敲除引物為:M-CTLA4-KO-S:5’-AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG-3’和MCTLA4-KO-A:5’-CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC-3’,可以檢測(cè)鼠源CTLA4基因。使用鼠尾直接PCR試劑盒進(jìn)行PCR,擴(kuò)增程序?yàn)?5℃15 min;(95℃30 s,60℃30 s,72℃2 min)×30循環(huán);72℃10 min。加入6×蛋白上樣緩沖液后,用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。使用敲除引物時(shí),小鼠子代PCR產(chǎn)物中若含有727 bp的片段,則小鼠含有正常鼠源CTLA4基因,若含有528 bp的片段,則小鼠含有敲除后的CTLA4基因,若含有1511 bp的片段,則小鼠含人源化的CTLA4基因。敲除小鼠子代若只含有敲除后的CTLA4基因而無(wú)正常鼠源基因,則為純合敲除小鼠。使用2對(duì)人源化檢測(cè)引物時(shí),人源化小鼠子代PCR產(chǎn)物中CTLA4人源基因上下游表達(dá),且大小正確,則小鼠含有該人源基因且插入位置正確,為雜合或純合小鼠,若同時(shí)使用敲除引物檢測(cè)未表達(dá)鼠源CTLA4基因,則為人源化純合小鼠。

隨后,選取包含突變的PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆,并進(jìn)行測(cè)序分析,確定DNA缺失片段信息。

1.2.4 CTLA4敲除及人源化小鼠出生后體重及生存率觀測(cè)

從出生后開(kāi)始記錄CTLA4人源化小鼠純合(CTLA4h/h)、同窩野生型(CTLA4m/m)、敲除小鼠純合(CTLA4-/-)、同窩野生型(CTLA4+/+)的生存率及體重變化,其中CTLA4h/h、CTLA4m/m小鼠的生存率及體重從出生后1月記錄至6月,CTLA4-/-、CTLA4+/+小鼠生存率記錄至第6周,體重從第14天記錄至第28天。

1.2.5 Western Blot檢測(cè)CTLA4蛋白在脾和肺中的表達(dá)。

取后續(xù)繁育的雄性CTLA4人源化小鼠純合(CTLA4h/h)(3月齡)及其同窩野生型(CTLA4m/m)各1只,雄性敲除小鼠純合(CTLA4-/-)(2周齡)及其同窩野生型(CTLA4+/+)各1只。將脾及肺組織置于研磨管中加入RIPA裂解液,使用多樣品研磨珠均質(zhì)儀提取蛋白,使用PAGE凝膠快速制備試劑盒(12.5%)制備膠,上樣量為每孔50μg。一抗CTLA4(1∶2500)和β-actin(1∶2000)使用一抗稀釋液進(jìn)行稀釋,二抗山羊抗兔(1∶5000)。

1.2.6 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,逆轉(zhuǎn)錄PCR)檢測(cè)CTLA4 mRNA在脾中的表達(dá)

取后續(xù)繁育的CTLA4人源化小鼠純合及其同窩野生各2只,獲取脾細(xì)胞后用MEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素,在37℃及5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),并用CD3抗體(0.1μg/mL)刺激培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)后,用TRIzol分離總RNA,并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。根據(jù)序列信息分別設(shè)計(jì)1對(duì)人源及1對(duì)小鼠源CTLA4 mRNA檢測(cè)引物(上海英濰捷基),分別為hCTLA4-F:5’-CCCTGCACTCTCCTG TTTTTTCT-3’,hCTLA4-R:5’-TTGATTTCCACTGGA GGTGCC-3’和mCTLA4-F:5’-CCTTTTGTAGCCCTG CTCACT-3’,mCTLA4-R:5’-TTCACTCTGCTTTCAT TAAAGGTAC-3’。使用針對(duì)人CTLA4的引物擴(kuò)增片段為273個(gè)堿基對(duì),而使用針對(duì)小鼠CTLA4的引物擴(kuò)增片段為278個(gè)堿基對(duì)。

1.2.7 HE染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞在組織中的分布

選用4周齡的CTLA4敲除小鼠和同窩野生型小鼠、3月齡CTLA4人源化小鼠和同窩野生型小鼠,福爾馬林固定24 h以上,取心臟及肝脫水、包埋、切片,最后進(jìn)行HE染色。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中各類細(xì)胞的比例

后續(xù)繁育的CTLA4h/h小鼠(3月齡)4只和CTLA4m/m小鼠(3月齡)5只,取外周血50μL(EDTA抗凝),使用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。每管血中加入40μL PBS+CD4(FITC)、B220(PE-Cy7)、CD8(APC)、CD11b(APC-Cy7)、NK1.1(SB436)、CD3(SB702)小鼠單克隆抗體各0.2μL。避光4℃孵育30 min,PBS洗3次,1500 r/min離心5 min,200μL PBS重懸,過(guò)濾后使用流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞,FlowJo軟件計(jì)算細(xì)胞表面抗原陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.9 腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

鼠源黑色素瘤細(xì)胞系B16獲贈(zèng)于本所腫瘤課題組。其所需培養(yǎng)基為RPMI 1640+10%FBS,培養(yǎng)條件:37℃,5%CO2。

1.2.10 腫瘤生長(zhǎng)和分析

在CTLA4h/h(左腋下)和CTLA4m/m小鼠(右腋下)皮下注射5×105個(gè)B16黑色素瘤細(xì)胞,并在細(xì)胞注射后第3、5、7天,腹腔注射伊匹木單抗(ipilimumab)每只100μg/100μL PBS。跟蹤測(cè)量腫瘤體積,計(jì)算公式為:V=ab2/2,其中a是長(zhǎng)徑,而b是短徑。在第14天處死小鼠,取腫瘤組織稱重。使用GraphPad Prism 5.0軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s),使用t檢驗(yàn)。在整個(gè)研究中,P<0.05差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

pUC57-sgRNA表達(dá)載體經(jīng)Bsa I酶切線性化,合成的CTLA4 sgRNA雙鏈的粘性末端與表達(dá)載體Bsa I酶切后的粘性末端相匹配,兩者連接,成功構(gòu)建CTLA4 sgRNA表達(dá)載體,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證序列正確。

2.2 CTLA4敲除及人源化小鼠的構(gòu)建

按照實(shí)驗(yàn)方案(圖1),將轉(zhuǎn)錄后的sgRNA和Cas9 mRNA混合后通過(guò)顯微注射技術(shù)注射到C57小鼠受精卵中,移植到ICR假孕鼠子宮內(nèi),共出生23只幼仔,剪取7～10日齡小鼠的鼠尾組織,提取DNA并進(jìn)行PCR(圖2a,c,d)。根據(jù)PCR結(jié)果,選取分子量不同于野生型條帶的PCR產(chǎn)物測(cè)序并與野生型小鼠CTLA4基因序列比較。結(jié)果顯示,3#,5#,9#,14#,23#小鼠發(fā)生基因敲入,4#,6#,7#,10#,15#小鼠發(fā)生基因敲除。將F0代敲除小鼠7#(雄)與C57小鼠進(jìn)行雜交,獲得雜合子CTLA4+/-,將F0代人源化小鼠14#(雄)與C57小鼠進(jìn)行雜交,獲得雜合子CTLA4h/m,將雜合子互交并將子代進(jìn)行基因型鑒定,得到純合敲除小鼠CTLA4-/-(圖2b)或純合人源化小鼠CTLA4h/h(圖2e～g),突變可穩(wěn)定傳代。

圖1 CTLA4人源化及敲除小鼠建立方案Note.With the participation of sgRNA and Cas9 mRNA,the first exon of mouse CTLA4 was cut.a.The 921 bp reading frame composed of the CDSregion of human CTLA4 and BGH Poly A was used to replace the coding region of the first exon of mouse CTLA4 to establish a humanized CTLA4 mouse.b.The reading frame did not replace the coding region of the first exon of mouse CTLA4 and a CTLA4 knockout mouse was established.Figure 1 Establishment of CTLA4 humanization and knockout mice

圖2 PCR鑒定F0代及子代小鼠基因型Note.M.Marker(TaKaRa,DL2000).H.H2O.1～23.F0 generation mice were generated by microinjection(a,c,d).-/-.CTLA4 homozygous mice.+/-.CTLA4 heterogeneous mice.+/+.Wild-type littermate mice(b).h/h.Humanized CTLA4 homozygous mouse.h/m.Humanized CTLA4 heterogeneous mouse.m/m.Wild-type littermate mice(e～g).The primer M-CTLA4-KO was used to identify the genotypes of knockout mice F0 generation(a)and its offspring(b).The primers M-CTLA4-UP(c,e)and M-CTLA4-DOWM(d,f)were used to identify the insertion position of the human gene in the F0 generation(c,d)and the offspring(e,f)of the CTLA4 humanized mice.The primer M-CTLA4-KO was used to identify the homozygous mouse(g).Figure 2 Identify the genotype of the F0 generation and offspring mice by PCR

2.3 CTLA4敲除及人源化小鼠生存率及體重變化

早有研究表明,CTLA4基因敲除小鼠會(huì)在出生后1月內(nèi),由于嚴(yán)重的自身免疫疾病死亡[12]。統(tǒng)計(jì)了小鼠出生后的生存率及體重變化,CTLA4-/-小鼠在出生后3～5周內(nèi)死亡(圖3a),而CTLA4h/h小鼠在6月內(nèi)生長(zhǎng)正常,未發(fā)生死亡(圖3b)。CTLA4-/-小鼠在出生后2周時(shí)體重與同窩野生型小鼠CTLA4+/+相似,但在3～4周時(shí)體重明顯低于CTLA4+/+小鼠(圖3c),體型也更小(圖3e),而CTLA4h/h小鼠在出生后6個(gè)月內(nèi)體重與同窩CTLA4m/m小鼠基本一致(圖3d),未見(jiàn)明顯異常。

圖3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及體重變化Note.a.Survival rate of CTLA4-/-and CTLA4+/+mice within 6 weeks of birth.CTLA4-/-mice died within 3～5 weeks after birth(n≥9).B.Survival rate of CTLA4h/h and CTLA4m/m mice within 6 months of birth(n≥7).c.Weight of CTLA4-/-and CTLA4+/+mice within 28 d of birth.CTLA4-/-mice gain weight slowly after 14 d of birth(n≥8).d.Weight of CTLA4h/h and CTLA4m/m mice within 6 months of birth(n≥7).e.Comparison of CTLA4-/-and CTLA4+/+mice of 4 weeks old.Figure 3 Changes of survival rate and weight of CTLA4 knockout mice

2.4 CTLA4敲除及人源化小鼠組織中蛋白及mRNA表達(dá)

為了鑒定CTLA4敲除及人源化小鼠是否在蛋白水平發(fā)生CTLA4敲除或人源化轉(zhuǎn)入,取1～2月齡小鼠脾、肺進(jìn)行Western Blot,分別使用種屬反應(yīng)性為小鼠和人的CTLA4抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)(圖4a)。結(jié)果顯示,在CTLA4-/-小鼠的脾和肺中,CTLA4表達(dá)被敲除。

由于市售的種屬反應(yīng)性為人的CTLA4抗體無(wú)法區(qū)分人源與鼠源的蛋白,為了區(qū)分人源與小鼠源CTLA4表達(dá),使用RT-PCR鑒定CTLA4h/h小鼠脾細(xì)胞(CD3抗體刺激4 d)中mRNA表達(dá)(圖4b)。結(jié)果可見(jiàn)人特異性引物只能擴(kuò)增CTLA4h/h的cDNA,而小鼠特異性引物也只能擴(kuò)增CTLA4m/m的cDNA,可見(jiàn)CTLA4h/h小鼠中只表達(dá)人源CTLA4的mRNA。

圖4 CTLA4在敲除小鼠及人源化小鼠中的蛋白及mRNA表達(dá)Note.m/m.Wild type littermate mouse.h/h.Humanized CTLA4 homozygous mouse.+/+.Wild type littermate mouse.-/-.CTLA4 knockout homozygous mouse.a.CTLA4 protein expression of spleen and lung in mice detected by Western Blot.b.CTLA4 mRNA expression of spleen in mice detected by RT-PCR.hCTLA4.Human specific CTLA4 primer.mCTLA4.Mouse specific CTLA4 primer.Figure 4 Expression of protein and mRNA in CTLA4 knockout and humanized mice

2.5 人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因

文獻(xiàn)報(bào)道,CTLA4-/-小鼠會(huì)由于嚴(yán)重的自身免疫疾病,在出生后3～4周內(nèi)死亡[12],這與觀察到的結(jié)果相似。HE染色結(jié)果顯示,相比于CTLA4+/+小鼠(圖5a,e),CTLA4-/-小鼠表現(xiàn)出淋巴樣細(xì)胞向非淋巴組織(如心臟、肝)的浸潤(rùn)(圖5b,f)。文獻(xiàn)報(bào)道,CTLA4敲除可導(dǎo)致動(dòng)物患有嚴(yán)重胰腺炎和致命的心肌炎[12-13]。但在CTLA4m/m小鼠(圖5c,g)及CTLA4h/h小鼠(圖5d,h)中,沒(méi)有觀察到淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),且全身病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常。結(jié)果表明,CTLA4h/h小鼠壽命正常,在6個(gè)月內(nèi)沒(méi)有觀察到自身免疫性疾病發(fā)展的跡象。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了CTLA4m/m和CTLA4h/h小鼠外周血中各類細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)其外周血中B細(xì)胞(B220+)、T細(xì)胞(CD3+、CD4+、CD8+)、粒細(xì)胞(CD11b+)和NK細(xì)胞(NK1.1+)的比例都沒(méi)有明顯差異(圖6)。結(jié)果說(shuō)明人源化CTLA4基因后沒(méi)有改變正常生理狀態(tài)下小鼠免疫系統(tǒng)的組成。因此,在CTLA4h/h小鼠中,人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。

圖5 組織中淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)Note.In CTLA4-/-mice,lymphocytes infiltrated extensively into non-lymphoid tissues(b,f),while in CTLA4+/+(a,e),CTLA4m/m(c,g)and CTLA4h/h(d,h)mice there was no significant infiltration.Figure 5 Lymphocyte infiltration in tissues

圖6 在CTLA4h/h小鼠外周血中不同免疫細(xì)胞的比例Note.m/m.Wild type mouse(n=6).h/h.Humanized CTLA4 homozygous mouse(n=4).a.Proportion of different immune cells in peripheral blood by flow cytometry.b～e.The expression of B220(b),CD3(c),CD11b(d),NK1.1(e)in peripheral blood by flow cytometry.Figure 6 Proportion of different immune cells in peripheral blood of CTLA4h/h mice

2.6 在CTLA4人源化小鼠中,CTLA4單克隆抗體伊匹木減緩腫瘤生長(zhǎng)速度

目前批準(zhǔn)用于臨床的抗CTLA4抗體可以與人源CTLA4結(jié)合,但不會(huì)與鼠源CTLA4交叉反應(yīng)[11]。為了檢測(cè)建立的CTLA4h/h小鼠是否可以用于臨床藥物篩選,對(duì)比了CTLA4單克隆抗體伊匹木[3]在CTLA4h/h和CTLA4m/m小鼠中抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。用黑色素瘤細(xì)胞系B16分別移植入CTLA4h/h和CTLA4m/m小鼠皮下,在移植后第3、5、7天,伊匹木單抗以每只100μg的劑量進(jìn)行3次腹腔注射,觀察腫瘤生長(zhǎng)至14 d。在CTLA4h/h小鼠中,伊匹木單抗減緩腫瘤生長(zhǎng)速度(圖7a,b),在第14天時(shí),CTLA4h/h小鼠中腫瘤質(zhì)量低于CTLA4m/m小鼠(圖7c,d)。結(jié)果顯示,伊匹木單抗可以在建立的CTLA4h/h小鼠中發(fā)揮有效作用。

圖7 在CTLA4h/h小鼠中,伊匹木抑制B16黑色素實(shí)體瘤惡性增殖Note.5×105 B16 melanoma cells were injected(s.c.)into CTLA4h/h(n=8)and CTLA4m/m(n=6)mice,and mice were treated(i.p.)with 100 μg ipilimumab per mouse on days 3,5 and 7,as indicated by arrows.Measure the tumor diameter to 14 d after cell injected(a,b).Weigh the tumor on the 14th day after cell injected(c,d).Compared with CTLA4m/m group,*P<0.05,**P<0.01.Figure 7 In CTLA4h/h mice,ipilimumab induced the malignant proliferation of B16 melanoma

3 討論

如今,小鼠常被用于新藥物研發(fā)和疾病機(jī)制研究。但由于物種差異,小鼠在藥物的代謝和毒理學(xué)特征方面不一定與人類相同,導(dǎo)致藥物在臨床測(cè)試的效果和安全性與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果所預(yù)測(cè)不同的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。為了減少物種差異,提高臨床前實(shí)驗(yàn)的可靠性,通常使用人源化小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),人源化小鼠是指攜帶人類基因、細(xì)胞或組織的嵌合體小鼠。在本實(shí)驗(yàn)中,使用CRISPR/Cas9這一常用方法[14]建立CTLA4基因敲除及人源化小鼠。

抗體療法是備受關(guān)注的免疫療法之一,治療性抗體大致分為兩類,第一類是抗體與癌細(xì)胞直接結(jié)合,通過(guò)免疫依賴性和/或非依賴性機(jī)制誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[15-18]。第二類是通過(guò)與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如T細(xì)胞)結(jié)合并激活而引起腫瘤排斥反應(yīng)[19-20]。初始T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào),即T細(xì)胞受體和T細(xì)胞共刺激途徑[21]。CTLA4最初被發(fā)現(xiàn)為一種傳遞抑制信號(hào),對(duì)于終止免疫反應(yīng)非常重要[12-13]。T細(xì)胞活化受到CTLA4的負(fù)面調(diào)節(jié),例如與CD28競(jìng)爭(zhēng)與它們共同配體B7.1和B7.2的結(jié)合[22]。盡管CTLA4調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的確切機(jī)制仍存在爭(zhēng)議,但CTLA4的抑制功能受到廣泛認(rèn)可[23]。所有CTLA4敲除小鼠在淋巴結(jié)和脾均顯示大量淋巴細(xì)胞增殖,隨后白細(xì)胞對(duì)幾乎所有組織進(jìn)行自身免疫攻擊,并導(dǎo)致小鼠過(guò)早死亡[12-13,24]。在純合CTLA4人源化小鼠中,一段時(shí)間內(nèi)(超過(guò)6個(gè)月)沒(méi)有觀察到致命的自身免疫疾病,這證明在人源化小鼠中,人和小鼠的CTLA4具有相同的生物學(xué)功能。

在研究治療性抗體的效果時(shí),可以使用免疫系統(tǒng)人源化小鼠進(jìn)行研究。如使用免疫缺陷小鼠進(jìn)行人外周血重構(gòu),從而在小鼠中建立功能正常的人免疫系統(tǒng)[25]。雖然這種模型可以用于篩選抗體的潛在抗癌作用,但在評(píng)估其它臨床參數(shù),如自身免疫性方面受到一定限制。此外免疫系統(tǒng)人源化小鼠容易產(chǎn)生移植物抗宿主病,或需要人細(xì)胞因子刺激使移植后的細(xì)胞存活增殖[26]。相比之下,CTLA4基因人源化小鼠的免疫應(yīng)答是在自然環(huán)境中產(chǎn)生的。并且,CTLA4基因人源化小鼠模型可以用于評(píng)估與潛在人類治療性抗體相關(guān)的自身免疫副作用的能力[3]。

因此,本研究建立的CTLA4人源化小鼠模型改善了CTLA4在人與小鼠中種屬差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異,從而使藥物評(píng)價(jià)的結(jié)果更加客觀,為治療性抗體的驗(yàn)證提供了更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。