構(gòu)建兔頸總動脈粥樣硬化斑塊模型的新方法及評價

葉鵬飛郭應(yīng)坤張怡沈夢婷李湘陳林徐婷文凌儀*

(1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院放射科,出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室,成都 610041;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科,成都 610041)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)所致的心血管疾病發(fā)病率高,危害性大,是導(dǎo)致腦卒中、冠心病、肢體功能喪失的主要原因[1-2],是世界人口死亡的主要原因[3]。雖然AS的臨床和基礎(chǔ)研究取得了較大進(jìn)展,但該病仍然是世界人口死亡的主要原因。構(gòu)建一種具有創(chuàng)傷小、簡單易行、建模時間短、成模率高、典型的頸AS斑塊模型,將有助于研究AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展、發(fā)病機(jī)制、綜合治療及決策。因此本研究意在探索一種簡單易行的兔頸總AS斑塊動物模型的構(gòu)建方法,為AS模型建立提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

20只(5.0±0.12)月齡健康雄性新西蘭的大白兔普通級,體重(2.1±0.63)kg,單籠喂養(yǎng),室內(nèi)溫度和濕度恒定,自由飲水,晝夜各12 h,由四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供【SCXK(川)2019-031】,【SYXK(川)2018-011】。將經(jīng)球囊損傷的右側(cè)頸總動脈作為實驗組,將未經(jīng)球囊損傷的左側(cè)頸總動脈作為自身對照組。所有新西蘭大白兔操作均符合四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院實驗動物福利與倫理委員會(倫理批準(zhǔn)號2019149A)。

1.1.2 主要試劑與儀器

4%多聚甲醛溶液(每瓶500 mL,南昌雨露實驗器材有限公司);蘇木精伊紅染色液(每瓶500 mL,南昌雨露實驗器材有限公司);二甲苯(每瓶500 mL,南昌雨露實驗器材有限公司)。

磁共振儀(Skyra3.0T,德國西門子);數(shù)字減影血管造影機(jī)(Allura Xper FD20,荷蘭飛利浦);動物呼吸機(jī)(R520,瑞沃德生命科技有限公司);透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F30,Field Electron and Ion Company);自動脫水機(jī)(KD-TS3,金華市宇典醫(yī)療器械廠);石蠟切片機(jī)(JYD-325,金華市宇典醫(yī)療器械廠);生物組織冷凍包埋機(jī)(KD-BM,金華市宇典醫(yī)療器械廠);穿刺針(24 G,北京安通醫(yī)療器械有限公司);微導(dǎo)管(1.8 F,益心達(dá)醫(yī)學(xué)新技術(shù)有限公司);導(dǎo)引導(dǎo)絲(0.014 in,Boston Scientific Corporation);PTA球囊導(dǎo)管(3 mm×20 mm,Boston Scientific Corporation)。

1.2 方法

1.2.1 球囊損傷兔頸總動脈內(nèi)膜

(1)術(shù)前準(zhǔn)備:將實驗動物用高脂飼料預(yù)喂養(yǎng)4周,術(shù)前禁食但不禁水12 h。

(2)手術(shù)具體步驟:用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮,按30～40 mg/kg的劑量肌肉注射進(jìn)行麻醉,約5～10 min后動物進(jìn)入麻醉狀態(tài),用電動剃毛刀剃除右側(cè)兔耳背側(cè)兔毛,充分暴露兔耳中央動脈。將兔左側(cè)臥位固定于DSA機(jī)手術(shù)臺上,用乙醇消毒兔耳,用棉簽來回摩擦兔耳中央動脈表面皮膚,力量稍重,擴(kuò)張兔耳中央動脈,用24 G穿刺針穿刺右側(cè)兔耳中央動脈,退出針芯同時進(jìn)針鞘,可見鮮紅血液流出,注射2 mL肝素水抗凝。將0.014 in微導(dǎo)絲由穿刺針針鞘進(jìn)入兔耳中央動脈,退出穿刺針鞘,然后用手術(shù)刀片于穿刺點處將皮膚切開一個小口,將1.8 F微導(dǎo)管在微導(dǎo)絲的導(dǎo)引下送入兔耳中央動脈,將微導(dǎo)絲彎頭轉(zhuǎn)向背側(cè),在導(dǎo)絲的引導(dǎo)下將微導(dǎo)管依次通過右側(cè)顳淺動脈、頸外動脈、頸總動脈,利用同軸交換技術(shù)將3 mm×20 mm球囊送入頸總動脈,約頸椎4～6椎體水平。用碘對比劑充盈球囊至12～14 KPa壓力保持60 s,間隔60 s,重復(fù)3次,并保持球囊內(nèi)壓力的條件下來回拖動球囊3次。將微導(dǎo)管與球囊進(jìn)行同軸交換,微導(dǎo)管連接到高壓注射器上,流速1 mL/s,流量3 mL,經(jīng)造影證實頸總動脈擴(kuò)張成功,取出微導(dǎo)管和微導(dǎo)絲,穿刺點壓迫止血,結(jié)束介入造模過程(見圖1和圖2)。

圖1 經(jīng)兔耳中央動脈穿刺入路Note.A.The right central artery of rabbit ear was punctured with a 24 G puncture needle.B.The 0.014 in micro-guide wire was inserted into the central artery of rabbit ear through the needle sheath.C,D.The sheath of the puncture needle was withdrawn,and the 1.8F microcatheter was sent into the central artery of rabbit ear under the guidance of the microguide wire.Figure 1 Puncture through central artery of rabbit’s ear

圖2 球囊擴(kuò)張兔頸總動脈Note.A.The ballon was located at the level of cervical 4～6 vertebral in right common carotid artery.B.Filling balloon with iodine contrast agent(white arrow)dilated the right common cartotid artery.Figure 2 Dilation of rabbit common carotid arty with balloon

(3)手術(shù)記錄:記錄手術(shù)準(zhǔn)備時間(從肌注麻醉藥開始,到開始穿刺血管之前)、穿刺時間、球囊放置時間、壓迫止血時間、總的操作時間、出血量及電離輻射劑量,術(shù)中出血量通過稱重法進(jìn)行測量[4]。

1.2.2 高脂飼料飼養(yǎng)

經(jīng)過介入手術(shù)行兔頸總動脈內(nèi)膜損傷的實驗兔,再用高脂飼料(1%膽固醇+基礎(chǔ)飼料)[5]喂養(yǎng)8周,一日3次,每次飼料量15 g/kg體重,飼料按照體重比例持續(xù)增加,依舊單籠喂養(yǎng),室內(nèi)溫度和濕度恒定,飲水自由,晝夜各12 h。

1.2.3 磁共振儀掃描

用德國西門子公司的Skyra 3.0 T磁共振儀(Magnetic resonance imaging,MRI)進(jìn)行掃描,采用8通道兔專用線圈。取仰臥位,尾先進(jìn),畫取兔第4～6頸椎椎體水平進(jìn)行普通和增強(qiáng)掃描?？焖僮孕夭═1加權(quán)序列(Turbo Spin Echo-Longitudinal relaxation time,TSE-T1WI),TE 10 ms,TR 600 ms,翻轉(zhuǎn)角120°,層厚2 mm,層間距0 mm,FOV 45 mm,矩陣0.44 mm×0.44 mm×2 mm。

數(shù)據(jù)導(dǎo)入離線工作站(Horos4.0.0.RC1)進(jìn)行圖像后處理,分別測量T1WI橫軸位普通和增強(qiáng)掃描圖像行雙側(cè)兔頸總動脈壁信號強(qiáng)度(signal intensity,SI)和背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation of the noise,SD)。選取血管壁最厚處為感興趣區(qū)(regional of interest,ROI)層面,選取血管壁3個不同位置進(jìn)行SI的測量,取其平均值,再選取圖像邊緣無組織處進(jìn)行SD的測量,計算獲得信噪比,計算公式為SNR=SI/SD。

1.2.4 病理組織學(xué)檢測

將兔麻醉后,用50 mL空氣注入兔耳緣靜脈處死實驗動物,行頸部正中切口約9～11 cm,完整取下主動脈弓和雙側(cè)頸總動脈,將標(biāo)本放入4%多聚甲醛的瓶內(nèi)固定,進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

2.1.1 實驗動物

本實驗成功構(gòu)建了17只兔頸總AS動物模型,成模率為85.0%(17/20)。

2.1.2 體重變化情況

將未進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)的兔在清晨未進(jìn)食前進(jìn)行稱重,高脂飼料總共喂養(yǎng)12周后清晨未進(jìn)食前進(jìn)行稱重。高脂飼料喂養(yǎng)前體重為(2.99±0.2)kg,高脂飼料喂養(yǎng)后體重為(3.53±0.21)kg,高脂飼料喂養(yǎng)后體重明顯增加(P<0.01)。

2.1.3 手術(shù)記錄結(jié)果

經(jīng)兔耳中央動脈穿刺入路,行球囊損傷頸總動脈內(nèi)膜手術(shù)各步驟的操作時間的結(jié)果:備皮時間(2.77±1.12)min、穿刺時間(4.36±1.48)min、球囊放置時間(13.53±5.19)min、壓迫止血時間(2.42±1.03)min、總的操作時間(29.08±5.72)min。術(shù)中出血量為(1.21±0.5)mL,電離輻射劑量為(2.68±0.93)mGy。

2.2 血管造影結(jié)果

2.2.1 球囊擴(kuò)張兔頸總動脈后DSA成像結(jié)果

所有兔在球囊擴(kuò)張兔頸總動脈前后,均進(jìn)行DSA成像,并測量其直徑,球囊擴(kuò)張兔頸總動脈前血管直徑(2.28±0.2)mm,球囊擴(kuò)張兔頸總動脈后血管直徑(2.84±0.18)mm,球囊擴(kuò)張兔頸總動脈后血管直徑較前明顯增加(P<0.01)。本實驗18號兔子,球囊擴(kuò)張兔頸總動脈前后DSA成像直徑如圖3所示。

圖3 球囊擴(kuò)張兔頸總動脈前后DSA成像Note.A.The diameter was 2.22 mm before balloon dilation.B.The diameter was 2.82 mm after balloon dilationFigure 3 DSA imaging before and after balloon dilation of rabbit common carotid artery

2.2.2 球囊損傷頸總動脈內(nèi)膜聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)后DSA結(jié)果

經(jīng)球囊損傷兔頸總動脈內(nèi)膜聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)8周后,進(jìn)行DSA成像,實驗組頸總動脈血管直徑為(2.75±0.25)mm,自身對照組頸總動脈血管直徑為(2.26±0.11)mm,實驗組血管直徑較自身對照組明顯增加(P<0.01)。本實驗15號兔子DSA成像后測量左右側(cè)血管直徑如圖4所示。

圖4 兔雙側(cè)頸總動脈DSA成像血管直徑Figure 4 DSA imaging of rabbit bilateral common carotied artery

2.3 MRI檢查結(jié)果

圖5為T1WI橫軸位普通掃描圖像;釓類對比劑注入7 min后,T1WI橫軸位增強(qiáng)掃描圖像上,實驗組頸總動脈血管壁增厚,明顯強(qiáng)化(白箭),如圖5B所示;自身對照組頸總動脈血管壁未見增厚,呈弱強(qiáng)化,如圖5A所示。

圖5 T1WI橫軸位掃描圖像Figure 5 Axis T1WI MRI image

2.4 病理對照

2.4.1 大體觀察

實驗組頸總動脈血管壁明顯增厚,僵硬無彈性,呈黃白色;自身對照組頸總動脈血管壁薄,柔軟富有彈性,呈粉紅色,實驗組頸總動脈管徑較自身對照組頸總動脈管徑明顯增粗。

2.4.2 光鏡觀察

實驗組頸總動脈血管壁內(nèi)膜增厚且不均勻,管腔變窄,內(nèi)皮細(xì)胞不完整排列,泡沫細(xì)胞大量聚集,平滑肌細(xì)胞大量浸潤,紊亂排列;中膜增厚,泡沫細(xì)胞較多,平滑肌細(xì)胞紊亂排列。自身對照兔頸總動脈血管壁內(nèi)膜光滑,未見增厚,未見泡沫細(xì)胞,中膜平滑肌細(xì)胞整齊排列(見圖6)。

圖6 兔頸總動脈切片光鏡圖像Figure 6 Microscope image of rabbit common carotid artery

3 討論

兔的脂蛋白代謝和血管結(jié)構(gòu)與人類非常相似,且對高脂飼料喂養(yǎng)敏感性高,因此常被選為AS斑塊模型[6],所形成的AS斑塊的病理性質(zhì)也與人類十分相似[7]。作為中等體型動物,兔具有體型大小適中、飼養(yǎng)方便、取血檢查方便及費用較低等優(yōu)點[8],所以本實驗選擇中等體型動物家兔作為研究對象。

AS斑塊是多種因素形成的結(jié)果,單一因素產(chǎn)生的AS可能與人類相比差別較大,采用復(fù)合方法構(gòu)建AS模型越來越受到研究者們的重視[9]。單純的較長時間的高脂飼養(yǎng)較易在腹主動脈形成AS斑塊,但不易在頸總動脈形成粥樣硬化斑塊,而高脂飼養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷動脈內(nèi)膜能夠成功構(gòu)建AS模型,球囊損傷動脈內(nèi)膜的方法不但可以選擇AS斑塊形成的部位,而且縮短了AS斑塊形成的時間[10],許振坤等[11]通過高脂飼養(yǎng)聯(lián)合球囊損傷動脈內(nèi)膜在短時間內(nèi)構(gòu)建了兔AS斑塊模型。

研究表明,高脂血癥激活體內(nèi)的炎癥免疫反應(yīng),使血管內(nèi)膜損傷,是AS形成的始動因素[12-13],球囊損傷動脈內(nèi)膜是通過介入手術(shù)將球囊放置在目標(biāo)血管,通過球囊機(jī)械性擴(kuò)張和拖動破壞動脈內(nèi)皮細(xì)胞[14],使內(nèi)皮細(xì)胞下的外源性凝血物質(zhì)暴露,血小板凝集在血損傷的血管壁上,能夠使AS斑塊模型的構(gòu)建周期縮短[15],并且可以指定病變產(chǎn)生的位置[16],是目前較廣泛應(yīng)用于AS斑塊模型構(gòu)建的方法。

通過球囊損傷動脈內(nèi)膜的方法構(gòu)建兔AS斑塊模型,通常是通過切開頸外動脈或股動脈的方法將球囊放入目標(biāo)動脈內(nèi),陸紅玲等[17]在兔左頸外動脈剪開一“v”形小口成功構(gòu)建了兔頸總動脈AS模型,張軍平等[18]在股動脈壁上剪開一“v”形小口,逆行置入球囊至胸主動脈,成功構(gòu)建了胸主動脈AS模型。這兩種置入球囊的方法都需要切開皮膚,鈍性分離局部組織,手術(shù)難度系數(shù)較大,操作相對較復(fù)雜,創(chuàng)傷較大,術(shù)后易感染,成模率低[19]。兔耳中央動脈位于兔耳皮下,位置表淺、易于觸及、容易觀察[20],本研究采用經(jīng)兔耳中央動脈穿刺入路,行球囊損傷兔頸總動脈內(nèi)膜,穿刺血管簡單,無須經(jīng)皮切開皮膚,無須鈍性分離局部組織,具有創(chuàng)傷小、操作簡便以及成模率高等優(yōu)點,是較好的手術(shù)穿刺入路部位。在2016年,劉文貴等[21]報道了經(jīng)兔耳中央動脈作為穿刺點行肝動脈置管,兔耳中央動脈穿刺入路具有創(chuàng)傷小、操作簡便以及成模率高等優(yōu)點。

本實驗通過球囊損傷兔頸總動脈內(nèi)膜,與AS斑塊形成的發(fā)病機(jī)制內(nèi)皮損傷學(xué)說類似,但是與人體自然形成的AS斑塊是不一樣的,并且本實驗形成的病變血管是擴(kuò)張的,還不是真正完全模擬人的AS斑塊的病理過程。

建立一種與人類AS十分相似的可行性動物模型,對于完善AS相關(guān)研究具有十分重要的價值,將有助于對AS斑塊的發(fā)生、發(fā)展、發(fā)病機(jī)制、綜合治療及決策進(jìn)行更全面深入的研究。一個好的動物模型不僅需要滿足研究人員對該疾病的基本需求,而且需要幫助研究人員拓展研究思路。在未來的工作中,還可能繼續(xù)嘗試誘導(dǎo)不同類型的兔頸總AS病變,包括細(xì)胞介導(dǎo)的鈣沉積、脂質(zhì)、纖維性和出血的慢性血管狹窄病變。

綜上所述,本文通過兔耳中央動脈穿刺入路,行球囊損傷兔頸總動脈內(nèi)膜聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方法成功構(gòu)建了兔頸總AS斑塊模型,該方法具有創(chuàng)傷小、操作簡單、可重復(fù)性強(qiáng)、造模時間短及成功率高等優(yōu)點。在穿刺入路選擇上,本實驗開創(chuàng)性的選擇兔耳中央動脈作為穿刺入路,成功構(gòu)建了兔頸總動脈AS斑塊模型,該方法有利于研究者們對AS斑塊進(jìn)行更加深入的研究。