膽酸誘導急性肺損傷小鼠模型的建立和評價

孫昂然劉嘉豪陳星君李夢春文成剛高敏胡章雪*

(1.陸軍軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院,重慶 400042;2.96961部隊衛(wèi)生隊,北京 102206;3.陸軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物教研室,重慶 400038)

胎兒將胎糞污染的羊水誤吸入肺所引起的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是新生兒重癥研究的一個重要問題[1],然而胎糞中的重要成分膽酸,是否在ALI中發(fā)揮關鍵作用,尚無直接證據(jù)。膽酸作為一種重要的致炎因子[2],主要用于重癥胰腺炎動物模型的構建[3],但能否誘導動物的肺損傷,尚無報道。本實驗旨在利用膽酸構建小鼠的肺損傷模型,為探究膽酸誘發(fā)新生兒肺損傷的分子機制提供基礎和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

54只6～8周C57BL/6清潔級野生型小鼠。雄鼠18只,體重(26.0±1.8)g;雌鼠36只,體重(19.3±2.4)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司【SCXK(京)2019-0010】。飼喂設施由陸軍特色醫(yī)學中心提供【SYXK(軍)2017-0057】,飼養(yǎng)條件:(22±2)℃,晝夜各半循環(huán)照明,自由采食飲水,飼養(yǎng)7 d后開始實驗。所有操作均符合陸軍軍醫(yī)大學實驗動物福利倫理審查委員會倫理學要求(審批號:AMUWEC 20201510)。

1.1.2 主要試劑與儀器

膽酸(Sigama,CAS:81-25-4);DMSO溶液(Solarbio,CAS:D8371);PBS溶液(Hyclone,CAS:SH30256.01);4%多聚甲醛固定液(碧云天,CAS:P0099);HE染色劑(碧云天,CAS:C0105);鼠TNFαELISA試劑盒(碧云天,CAS:PT512);鼠IL-1β ELISA試劑盒(碧云天,CAS:PI301);血氣分析測試卡片(Abbott Point of Care Inc,CAS:03P88-25)。

小動物X光機(faxitron X-ray,MX-20,美國);手術器械(碧云天);電子天平(北京賽多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備

膽酸以DMSO溶解,再用PBS稀釋,使其終濃度為5 mmol/L。

1.2.2 動物分組

按照給藥方法×藥物(3×3)析因設計分組小鼠。給藥方法分為:氣管切開、鼻滴1 d,鼻滴6 d。藥物為膽酸,并且設置其對應的溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組,共9組,每組6只(雌鼠4只,雄鼠2只)。如表1所示。鼻滴給藥處理的頻率為每天1次,其中鼻滴1 d是指鼻滴給藥處理1 d,鼻滴6 d是指鼻滴給藥處理連續(xù)6 d,并且兩次鼻滴間隔時間為24 h。

表1 給藥方法×藥物(3×3)析因設計小鼠分組Table 1 Administration method×drug(3×3)factorial design mice group

1.2.3 動物模型制備

氣管切開灌肺模型:腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠。待小鼠肌肉松弛,四肢無活動后,充分暴露小鼠氣管,在軟骨間環(huán)狀韌帶處用眼科角膜剪剪開直徑約2 mm開口,用微量加樣槍灌注膽酸(0.1 mmol/kg),再推入1 mL空氣,最后縫合。同理分別灌注溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組。

鼻滴膽酸入肺模型:麻醉后,膽酸經(jīng)鼻滴入小鼠(5μmol/kg)。鼻滴持續(xù)時間1～2 min。溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組的動物,其處理方式同膽酸組。

1.2.4 一般體征觀察

處置完成后,小鼠回籠飼養(yǎng),給予充足的水和飼料,觀察其飲食、活動等一般情況。連續(xù)鼻滴6 d的小鼠,每日稱量體重,以粗略判斷其健康狀況。

1.2.5 樣品檢測

(1)胸部X線檢查:小動物X光機參數(shù)設置:曝光時間18 s,管電壓26 kV。

(2)血氧分壓檢測:麻醉后,打開小鼠胸腔,用肝素化的1 mL空針在心尖搏動出穿刺抽取0.15 mL血液,將血氣標本注入血氣測試卡片中檢測血氧分壓(blood oxygen partial pressure,PO2)。

(3)觀察肺組織的大體改變:離體肺組織以PBS溶液沖洗后,觀察肺葉出血、水腫情況,組織表面斑塊、顏色并拍照。

(4)觀察肺組織病理學變化:取右肺上葉,經(jīng)4%多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片和HE染色,再用光學顯微鏡觀察小鼠肺組織的病理變化。

(5)ELISA法檢測小鼠肺組織中TNF-α和IL-1β的含量:取一部分組織提取蛋白,經(jīng)ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量。操作嚴格按照試劑說明進行,用酶標儀測定OD值后再計算試劑樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

將血氧分壓值、TNF-α和IL-1β的含量分別作為計量資料。對血氧分壓結果采取3×3析因設計資料方差分析和單因素方差分析,對TNF-α和IL-1β的含量采取3×3析因設計資料方差分析。P<0.05則表示差異有統(tǒng)計學意義。用SPSS 20.0軟件進行分析,用GraghPad Prism 8.0.1繪制統(tǒng)計分析圖。

2 結果

2.1 一般體征觀察

9組小鼠完成給藥后全部存活。氣管切開膽酸組與其溶劑對照DMSO組,或者與其空白對照PBS組相比,小鼠蜷縮,活動和飲食減少。膽酸鼻滴1 d組與其相應的溶劑對照DMSO組或空白對照PBS組相比,小鼠活動和飲食情況正常。膽酸鼻滴6 d從第4天開始,活動和飲食減少;溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組小鼠,從第5天開始活動和飲食減少。膽酸鼻滴6 d組及其溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組,3組小鼠體重均下降(如圖1所示),但鼻滴結束時,各組間比較,均無顯著性差異(P>0.05),說明3組小鼠營養(yǎng)狀況相似。

圖1 小鼠體重的變化Figure 1 Alteration in mice body weight

2.2 小鼠胸部X線片

氣管切開膽酸組與空白對照PBS組、溶劑對照DMSO組相比,肺紋理增多、肺野透光度降低,呈毛玻璃樣改變,但未見心影增大、支氣管充氣(如表2,圖2 a、b、c所示)。鼻滴1 d除膽酸組中有2例肺紋理增多,其余均未見異常(表2,圖2 d、e、f所示)。鼻滴6 d膽酸組,有3例肺紋理增多,伴有毛玻璃樣改變和散在小斑片樣陰影,溶劑對照DMSO組中,有2例肺紋理增多(如表2,圖2 g、h、i所示)。

圖2 不同處理后小鼠出現(xiàn)肺彌漫性浸潤表現(xiàn)的情況Figure 2 X-ray of diffuse lung infiltration in mice after different treatments

表2 不同處理后小鼠肺出現(xiàn)彌漫性浸潤的例數(shù)Table 2 Number of cases of diffuse infiltration of mouse lungs after different treatments

2.3 肺組織大體觀察

氣管切開手術處理的小鼠中,空白對照PBS組的小鼠肺表面未見局灶性出血(圖3a),但是膽酸組和溶劑對照DMSO組中,均可見肺局灶性出血(圖3b、c)。鼻滴1 d處理的小鼠中,膽酸組、溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組均未見肺局灶性出血(如圖3 d、e、f所示)。鼻滴6 d處理的小鼠中,膽酸組、溶劑對照DMSO組和空白對照PBS組的肺表面均有廣泛出血(如圖3 g、h、i所示)。

圖3 不同處理后小鼠肺大體樣本出血表現(xiàn)的情況Figure 3 Bleeding manifestations of mouse lung gross samples after different treatments

2.4 血氧分壓檢測

以血氧分壓(PO2)作為測量指標進行析因分析。首先分析藥物因素單獨效應,膽酸組顯著低于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.05),說明膽酸可以誘導PO2降低(如表3所示)。再分析手術方法(包括氣管切開、鼻滴1 d和鼻滴3 d)的單獨效應,氣管切開組與鼻滴1 d組或者鼻滴6 d組相比,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但是鼻滴6 d組與鼻滴1 d組相比較,PO2顯著降低(P<0.01),說明較長時間鼻滴(6 d)比短時間鼻滴(1 d)更加影響血氧分壓(如表4所示)。

表3 藥物因素單獨效應各藥物組間PO2比較Table 3 Comparison of PO2 between drug groups in individual effects of drug factors

表4 給藥方法因素單獨效應各藥物組間PO2比較Table 4 Comparison of PO2 between each drug group by factors of administration method alone effect

在析因分析后,對3種給藥方式分別進行單因素方差分析。在氣管切開小鼠中,膽酸組顯著低于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.01),說明氣管切開手術條件下再灌注膽酸能有效降低血氧分壓。鼻滴1 d時,膽酸組與其溶劑對照組和空白對照組相比,均無統(tǒng)計學差異(P>0.05),說明鼻滴1 d膽酸不能造成小鼠的肺損傷。鼻滴6 d膽酸組與其溶劑對照組和空白對照組相比,均有降低,但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(如圖4)。

圖4 不同給藥方法分別進行藥物組間比較血氧分壓情況Note.Compared with cholic acid group,**P<0.01,***P<0.001.Figure 4 Compare the blood oxygen partial pressure between the drug groups with the drug groups with the different admistration methods

2.5 肺組織病理觀察

氣管切開手術的3組小鼠中,膽酸組與其溶劑對照DMSO組或空白對照PBS組相比,肺泡腔結構破壞、出血和肺泡壁增厚(如圖5 a、b、c)。鼻滴1 d的3組小鼠中,膽酸組表現(xiàn)為散在的局灶性出血,但肺泡結構和肺內血管并無顯著改變(如圖5 d、e、f所示)。鼻滴6 d的3組小鼠中,膽酸組的肺泡壁有明顯的增厚,肺泡壁破壞嚴重,血管周圍和肺間質的炎細胞浸潤(如圖5 g、h、i所示)。

圖5 不同處理方法對小鼠肺病理學的影響(HE染色)Figure 5 Effects of different treatment methods on lung pathology in mice(HE staining)

2.6 肺組織中TNF-α和IL-1β檢測

以TNF-α和IL-1β作為測量指標進行析因設計。首先分析藥物因素單獨效應,膽酸組TNF-α,IL-1β顯著高于空白對照組(P<0.001)和溶劑對照組(P<0.001)(如表5、6所示)。接著分析給藥方法單獨效應,鼻滴1 d的小鼠,其TNF-α和IL-1β顯著低于氣管切開小鼠(P<0.001)和鼻滴6 d的小鼠(P<0.001),但是氣管切開小鼠和鼻滴6 d小鼠之間無統(tǒng)計學差異(如表7、8)。最后分析給藥方法和藥物是否存在交互作用。由于氣管切開且灌注膽酸的小鼠,其TNF-α含量(138.07±15.02 pg/mL)和IL-1β(232.06±45.89 pg/mL)含量均高于其它各組,析因分析顯示出給藥方法和藥物之間存在交互作用(如圖6所示)。

圖6 給藥方法與藥物之間的交互效應Note.A.TNF-αcontent.B.IL-1βcontent.Figure 6 Interaction between drug delivery method and drug

表5 藥物因素單獨效應各藥物組間TNF-α含量比較Table 5 Comparison of TNF-αcontent among different drug groups in individual effects of drug factors

表6 藥物因素單獨效應各藥物組間IL-1β含量比較Table 6 Comparison of IL-1βcontent among different drug groups in individual effects of drug factors

表8 給藥方法因素單獨效應各藥物組間IL-1β含量比較Table 8 Comparison of IL-1βbetween each drug group by factors of administration method alone effect

3 討論

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是一種常見的新生兒重癥,而胎兒將胎糞污染的羊水誤吸入肺所造成的ALI可進一步引發(fā)嚴重的并發(fā)癥,危及胎兒生命。胎糞的成分復雜,包括膽酸、膽酸鹽、膽固醇及其前體、脂質、胰磷脂酶A2、超多糖及蛋白質等[4-5]。膽酸是一種強烈的致炎因子,用于重癥胰腺炎動物模型的構建[3]。模型中膽酸可以引起肺損傷[6],從而提示,如果用膽酸刺激肺,肺表現(xiàn)的炎性損傷可能會與胎兒的胎糞吸入所造成的ALI具有一定的相似性。

根據(jù)美國胸科協(xié)會對急性肺損傷動物模型的判斷標準,只要具備組織損傷證據(jù)、肺泡毛細血管屏障改變的證據(jù)、炎癥反應證據(jù)和生理功能障礙證據(jù)中的至少三項[7-8],即為ALI動物模型造模成功。目前,ALI動物模型主要分為直接和間接損傷兩大類:直接肺損傷模型包括鹽酸吸入模型、脂多糖[9]或油酸[10]注射模型、機械通氣模型[11]以及病毒感染模型等;間接肺損傷模型包括內毒素模型、燒傷/煙霧吸入模型、輸血模型、缺血-再灌注模型及胰腺炎模型等。但是這些模型不能模擬胎兒吸入胎糞引起的ALI。目前未見以膽酸直接刺激肺構建的ALI的模型。如果建立以膽酸灌注入肺誘發(fā)急性肺損傷(ALI)的動物模型,則能為探討新生兒胎糞吸入所誘發(fā)的急性肺損傷機制奠定基礎。

本實驗把膽酸通過氣管切開、鼻滴1 d和鼻滴6 d的方式給予小鼠。鼻滴法給藥多用于臨床治療,也用于誘發(fā)肺炎的相關實驗[12-13]。鼻滴膽酸6 d的小鼠,X胸片、組織病理變化、血氧分壓、炎性因子TNF-α和IL-1β等各項指標都反映出其肺部炎癥比鼻滴膽酸1 d的小鼠更加嚴重,表明重復鼻滴給藥造成的肺損傷更加嚴重。鼻滴膽酸6 d的小鼠相對于其溶劑對照組和空白對照組,胸片、TNF-α和IL-1β的改變不及組織病理的變化,原因可能是小鼠肺損傷炎癥性滲出期在24～48 h[7,13],TNF-3和IL-1β釋放高峰在損傷后2 h和24 h[14],組織病理改變晚于炎癥損傷,但是拍攝胸片和采集肺組織樣本是在鼻滴6 d后,可能錯過了肺部炎性滲出的峰值期和TNF-α和IL-1β釋放的高峰期,故胸片只有輕微的彌散性浸潤,TNF-峰含量膽酸組甚至低于溶劑對照組。如果能夠連續(xù)拍攝X胸片和采集肺組織樣本,檢測炎性相關指標,則能提供一個更加合理的給藥時間,有利于構建鼻滴膽酸誘導ALI的動物模型。

鼻滴6 d是連續(xù)刺激肺組織造成損傷。鼻滴6 d的3組小鼠,X胸片、大體樣本、血氧分壓指標都發(fā)生了明顯的肺損傷,提示6 d的重復鼻滴給藥的方式是造成肺損傷的重要原因。鼻滴引起小鼠的嗆咳,使滴入物進入肺組織引發(fā)炎癥反應,即使膽酸有致炎效應,也可能被鼻滴掩蓋,所以鼻滴膽酸組與鼻滴DMSO組或鼻滴PBS組之間,除肺病理組織損傷一項證據(jù),其余各項指標沒有明顯差異,說明鼻滴6 d膽酸不能有效誘導小鼠的ALI模型。如果要采用鼻滴造模,則要調整鼻滴藥物的劑量和時間以取得其他相關實驗證據(jù)。

本研究還通過氣管切后再灌注膽酸以誘導形成ALI的動物模型。相較鼻滴滴入,氣管切開后藥物直接抵達肺組織,嗆咳排出的藥物體積較小,可以準確計量灌注劑量。并且,膽酸只作用于肺,不進入消化道,作用器官單一。氣管切開再灌注膽酸的小鼠,其X線胸片、組織病理變化、血氧分壓、TNF-α和IL-1β各項指標,較其溶劑對照組和空白對照均有顯著改變,具備了組織病理、炎癥反應和生理功能障礙這三項實驗證據(jù),證明氣管切開確實能成功誘導ALI,形成膽酸誘導的ALI動物模型。

4 結論

本實驗探討了膽酸誘導小鼠急性肺損傷模型的構建,結果表明,氣管切開灌注膽酸構建急性肺損傷小鼠模型周期短,藥物劑量可控,重復性好,是一種相對可靠的構建方法。該模型的建立將為探究膽酸誘發(fā)新生兒肺損傷的分子機制提供基礎和依據(jù)。