Prnp-SNCA-A53T帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠腸道菌群差異

徐美玲張帆張瑜桑明王普清*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院,湖北 襄陽(yáng) 441000;2.湖北省帕金森病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,湖北 襄陽(yáng) 441000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性脫失,殘存神經(jīng)元中α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成路易小體[1]。常見(jiàn)臨床表現(xiàn)包括運(yùn)動(dòng)癥狀(肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、靜止性震顫、姿勢(shì)步態(tài)障礙)和非運(yùn)動(dòng)癥狀(胃腸功能紊亂、便秘、嗅覺(jué)障礙、抑郁、睡眠紊亂、認(rèn)知障礙和自閉等),其中部分非運(yùn)動(dòng)癥狀的出現(xiàn)明顯早于運(yùn)動(dòng)癥狀。目前PD確切病因仍不清楚,過(guò)去的研究顯示PD與遺傳及環(huán)境等因素有關(guān),但近年來(lái),諸多的證據(jù)表明PD的發(fā)病可能起源于胃腸道且與腸道菌群失調(diào)有關(guān)[2-5]。其中1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)毒物模型及α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型均被用于PD研究。MPTP帕金森病模型小鼠已被證實(shí)存在腸道菌群失調(diào)[6-7],而α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型是否存在菌群失調(diào)尚未進(jìn)行全面研究。

目前有多種α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型,α-突觸核蛋白點(diǎn)突變A53T被證實(shí)與PD相關(guān)[8-9]。其中Prnp-SNCA-A53T轉(zhuǎn)基因小鼠模型是將A53T突變型人α-突觸核蛋白基因?qū)胄∈篌w內(nèi),同時(shí)在Prnp啟動(dòng)子下表達(dá)。該模型可以很好的模擬帕金森癥的發(fā)病情況,是研究PD發(fā)病機(jī)制較理想的小鼠模型。但是該模型小鼠是否也存在腸道菌群失調(diào)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此,本研究擬通過(guò)illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)Prnp-SNCA-A53T轉(zhuǎn)基因模型小鼠腸道微生物生態(tài)特征進(jìn)行分析研究,為探究糞便微生物與PD的相關(guān)性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7只13周齡SPF級(jí)雌性A53T轉(zhuǎn)基因小鼠及13只同性別同周齡野生型C57BL/6小鼠,共20只,體重20～24 g。Prnp-SNCA-A53T小鼠【SCXK(蘇)2018-0008】由武漢大學(xué)張振濤教授實(shí)驗(yàn)室【SYXK(鄂)2015-0027】贈(zèng)予,送至華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行快速擴(kuò)繁【SYXK(鄂)2015-0019】后,飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室【SYXK(鄂)2017-0093】,飼養(yǎng)期間各組小鼠可自由獲得食物和水。飼養(yǎng)環(huán)境:晝夜各半循環(huán)照明,濕度控制在40%～60%,溫度控制在(24±2)℃。本研究方案獲湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019DW008),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器

TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒(DP328-02,TIANGEN),AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒APGX-250(Scipu003357,AXYGEN)。

生物安全柜(Hfsmfe-1500LC,上海力申科學(xué)(力康),中國(guó)),電泳儀,微量分光光度計(jì)(N50 Touch,Nanophotometer,德國(guó)),NovaSeq 6000測(cè)序儀(Illumina,美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取7只SPF級(jí)雌性A53T轉(zhuǎn)基因小鼠作為A53T組,同時(shí)選取同性別同周齡13只野生型C57BL/6小鼠作為對(duì)照組。所有小鼠在13周齡時(shí)收集糞便樣品。

1.2.2 糞便的留取及其細(xì)菌DNA提取

在生物安全柜中分別收集每只小鼠新鮮糞便于無(wú)菌EP管中,按照糞便基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取糞便細(xì)菌總DNA。用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),檢測(cè)合格的DNA保存于-80℃冰箱備用。

1.2.3 16SrRNA擴(kuò)增及測(cè)序

糞菌DNA冷鏈郵寄至微基生物科技(上海)有限公司,使用NGSIllumina進(jìn)行細(xì)菌16SrRNA高通量測(cè)序。其中擴(kuò)增16SV3-V4可變區(qū)的通用引物為357F(5′-ACTCCTACGGRAGGCAGCAG-3′),806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.2.4 生物信息分析

下機(jī)后原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾,去除N含量超過(guò)10%、低質(zhì)量(Q≤5)堿基數(shù)超過(guò)50%及barcode序列,以獲得高質(zhì)量的Clean data用于后期分析[10]。通過(guò)FastQC(v 0.11.8)軟件對(duì)Clean data進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,利用QIIME2軟件按照97%的相似性閾值序列劃分為操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)。通過(guò)與Green genes 13.5數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋。基于OTU和物種注釋結(jié)果計(jì)算各樣本在門(mén)(phylum),綱(class),目(order),科(family),屬(genus)5個(gè)分類(lèi)水平上的組成和相對(duì)豐度表,比較物種間差異。通過(guò)α多樣性分析(αdiversity)得到糞便微生物的物種豐度和多樣性信息。通過(guò)β多樣性分析(β-diversity)分析兩組組間物種的整體差異。最后利用PICRUSt軟件對(duì)樣本中可能存在的各級(jí)KEGG通路及豐度值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 序列登錄號(hào)

研究所得序列均已提交至NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫(kù)中,Bio Project編號(hào)為PRJNA675446。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用R(4.0.2)軟件及Graph Pad Prism(8.0.2)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)兩組間差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(±s)表示,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本測(cè)序量及小鼠腸道菌群多樣性評(píng)估

本次高通量焦磷酸測(cè)序共產(chǎn)生748 828條高質(zhì)量序列,其中A53T組獲得278 329條有效序列(平均每個(gè)樣品序列數(shù)為39 761±3064);對(duì)照組獲得470 499條有效序列(平均每個(gè)樣品序列數(shù)為36 192±3311)。A53T組和對(duì)照組分別鑒定出672和1041個(gè)OTU,其中237種OTU為2組共有,A53T組包含435種特有OTU,而對(duì)照組包含804種特有OTU。α多樣性可以體現(xiàn)組內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)群落豐富度指數(shù)和群落多樣性指數(shù)進(jìn)行比較分析,結(jié)果如圖1所示,其中Goods_coverage反映測(cè)序深度,兩組測(cè)序的深度指數(shù)均接近1,結(jié)果說(shuō)明測(cè)序深度均已經(jīng)覆蓋到樣本中的所有物種(圖1A)。ace指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)分別反映菌群豐度和多樣性,結(jié)果顯示,A53T組的ace指數(shù)(圖1B)和Shannon多樣性指數(shù)(圖1C)均大于對(duì)照組,但兩者差異不顯著。

圖1 A53T組與對(duì)照組小鼠腸道微生物α多樣性分析Figure 1 α-diversity analysis of gut microbes in A53T and control group

2.2 腸道微生物β多樣性分析

本文采用weighted UniFrac指數(shù)衡量β多樣性,β多樣性分析是用來(lái)比較物種多樣性的差異大小,利用該指數(shù)得到的分析圖中距離越大表示樣本間的差異越大。主坐標(biāo)分析PCoA顯示A53T組和對(duì)照組基本處于不同區(qū)域,提示兩組之間多樣性存在差異(見(jiàn)圖2)。

圖2 A53T組與對(duì)照組小鼠腸道微生物β多樣性分析Figure 2 β-diversity analysis of gut microbes in A53T and control group

2.3 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成

所有樣本共鑒定得到8個(gè)門(mén)、18個(gè)綱、14個(gè)目、15個(gè)科和38個(gè)屬。對(duì)A53T組及對(duì)照組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,兩組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)、綱、目、科及屬水平均存在差異,其分組百分比堆積柱形圖如圖3所示。其中,兩組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)在門(mén)水平主要由厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Actinobacteria)及放線菌門(mén)(Actinobacteria)組成,其中A53T組的含量分別為17.1%、7.51%、0.88%及1.24%,而對(duì)照組分別為21.84%、11.94%、1.13%及0.57%,在屬水平主要由毛螺旋菌屬(Moryella)、擬桿菌屬(Bacteroides)及李斯特氏菌屬(Ammoniphilus)組成,其中A53T組的含量分別為11.95%、5.36%及1.95%,而對(duì)照組分別為17.38%、10.01%及1.66%。值得注意的是兩組小鼠腸道中均存在大量無(wú)法鑒定的細(xì)菌。

圖3 A53T組與對(duì)照組小鼠腸道微生物在門(mén)、綱、目、科及屬水平分組百分比堆積柱形圖Note.A.Phylum level.B.Class level.C.Order level.D.Family level.E.Genus level.A53T mice(n=7),control mice(n=13).Figure 3 Analysis of the microbial structure at the phylum,class,order,family and genus level respectively in A53T and control group.

2.4 兩組小鼠腸道菌群差異物種分析

為了比較兩組小鼠腸道菌群的差異物種,本研究分別在門(mén)、綱、目、科及屬水平分析腸道菌群的變化情況。在門(mén)水平,A53T組小鼠腸道微生物中放線菌門(mén)相對(duì)含量顯著較高(P=0.0094),而擬桿菌門(mén)顯著較低(P=0.0498);在綱水平,紅蝽菌綱(Coriobacteriia)增高(P<0.0001),擬桿菌綱(Bacteroidia)降低(P=0.0398);在目水平,紅蝽?xiàng)U菌目(Coriobacteriales)增高(P<0.0001),擬桿菌目(Bacteroidales)降低(P=0.0398),紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)降低(P=0.0185);在科水平,紅蝽?xiàng)U菌科(Coriobacteriaceae)增高(P<0.0001),擬桿菌科(Bacteroidaceae)降低(P=0.0277),紅桿菌科(Rhodobacteraceae)降低(P=0.0185);在屬水平,伊格爾茲氏菌屬(Eggerthella)顯著較高(P=0.0002),而擬桿菌屬(Bacteroides)(P=0.0277)和紅桿菌屬(Rhodobacter)顯著較低(P=0.0249)(見(jiàn)圖4)。

圖4 A53T組與對(duì)照組腸道微生物物種差異分析Note.A53T group(red)n=7.Control group(blue)n=13.Compare the percentage of microbe in the two groups,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.(The same in the following figures)Figure 4 Analysis of the difference of gut microbial between A53T and control group

2.5 PICRUSt腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析

根據(jù)OTUs在每個(gè)樣本中的表達(dá)豐度使用PICRUSt在線預(yù)測(cè)功能對(duì)各級(jí)KEGG通路及豐度值進(jìn)行預(yù)測(cè),共富集到328個(gè)功能通路,與對(duì)照組相比,A53T組有9條通路有顯著性差異(P<0.05,圖5),其中與環(huán)境信息處理相關(guān)的是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors);與代謝相關(guān)的包括:類(lèi)固醇激素合成(steroid hormone biosynthesis)、青霉素和頭孢菌素生物合成(penicillin and cephalosporin biosynthesis)、泛醌和其他萜類(lèi)醌的生物合成( ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、甲苯降解(toluene degradation)及聚糖的生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism);與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的包括:電子轉(zhuǎn)移載體(electron transfer carriers)和減數(shù)分裂(meiosisyeast);與人類(lèi)疾病相關(guān)的是非洲錐蟲(chóng)病(african trypanosomiasis)。說(shuō)明A53T組與對(duì)照組之間的差異可能與這些功能通路相關(guān)。

圖5 A53T組與對(duì)照組差異通路圖Figure 5 Diagram of the differential pathway between A53T and control group

3 討論

胃腸道被稱為人的第二大腦[11-12],其內(nèi)寄居大量的腸道微生物,正常的菌群結(jié)構(gòu)保障人體代謝、免疫、內(nèi)分泌功能處于較為穩(wěn)定的水平,而腸道菌群紊亂與多種疾病的發(fā)生可能存在相關(guān)性[13-17]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示PD患者與健康對(duì)照組相比腸道微生物存在差異[4,18-23],并提出腸道菌群紊亂可能與PD發(fā)病相關(guān)聯(lián),但兩者的因果關(guān)系尚不明確。目前多個(gè)研究者[6-7]選用MPTP等毒物模型研究腸道微生物與PD相關(guān)性及作用機(jī)制,但是相比于毒物模型,轉(zhuǎn)基因模型可以更好地模擬帕金森病的病理學(xué)及行為學(xué)改變。因此,本研究從多樣性及物種結(jié)構(gòu)水平上分析Prnp-SNCA-A53T帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠腸道菌群情況,并利用PICRUST預(yù)測(cè)其功能通路的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)A53T組小鼠α多樣性的ace指數(shù)及Shannon指數(shù)與對(duì)照組相比,雖然沒(méi)有顯著差異,但顯示有上升趨勢(shì),該結(jié)果同MPTP小鼠模型的研究存在一致性[24]。β多樣性及物種結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示,兩組的糞便微生物物種存在顯著性差異,本研究分別在門(mén)、綱、目、科和屬水平對(duì)差異菌群進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠腸道微生物的放線菌門(mén)、紅蝽菌綱及伊格爾茲氏菌屬增高,而擬桿菌門(mén)及紅細(xì)菌目降低,與在PD患者腸道微生物研究結(jié)果具有相似性[25-26]。

其中放線菌是厭氧或兼性厭氧菌,主要寄居在口腔、呼吸道、消化道和泌尿道的一種條件致病菌,當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí),可導(dǎo)致各種感染[27]。有研究認(rèn)為帕金森病可能是放線菌潛伏感染所誘發(fā)的,當(dāng)隨著年齡的增長(zhǎng)或者放線菌吞噬功能減退時(shí)引發(fā)PD[28]。伊格爾茲氏菌也屬于放線菌門(mén),被認(rèn)為與炎癥相關(guān)。同時(shí),本研究在轉(zhuǎn)基因小鼠中還發(fā)現(xiàn)紅蝽菌豐度增高,有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)肥胖個(gè)體腸道菌群中紅蝽菌科豐度增高,提示該物種可能具有導(dǎo)致代謝紊亂的作用[29]。

本研究還發(fā)現(xiàn),相對(duì)于野生型小鼠,A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腸道擬桿菌門(mén)及紅細(xì)菌目降低。有國(guó)外學(xué)者對(duì)擬桿菌的益生菌作用進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)擬桿菌在幫助宿主分解多糖[30]、加快腸粘膜血管形成[31]、免疫系統(tǒng)發(fā)育[32]、維持腸道微生態(tài)平衡[33-34]等方面發(fā)揮著重要的作用。擬桿菌的減少,導(dǎo)致腸道粘膜屏障破壞及通透性增加,腸道細(xì)胞和細(xì)胞毒素接觸增多,引起胃腸道局部及系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng),從而引發(fā)腸神經(jīng)系統(tǒng)中α-syn積累,再通過(guò)腸-腦軸引發(fā)腦黑質(zhì)神經(jīng)炎癥反應(yīng)和損傷[35]。以上提示A53T小鼠存在機(jī)會(huì)致病菌增多而有益菌減少,這與在帕金森病患者的研究結(jié)果一致,即轉(zhuǎn)基因小鼠也存在菌群失調(diào)。

信號(hào)通路預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),兩組小鼠存在9個(gè)通路的功能差異,其中相對(duì)于野生型小鼠,A53T轉(zhuǎn)基因小鼠G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)下降。G蛋白偶聯(lián)受體是細(xì)胞信號(hào)受體中最大的一個(gè)家族,參與多個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,能結(jié)合細(xì)胞周?chē)h(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)并激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路,最終引起細(xì)胞狀態(tài)的改變。2020年Khakisahneh研究小組[36]證實(shí)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸(SCFA),可作為旁分泌或內(nèi)分泌因子,通過(guò)作用于細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體,抑制上皮和腸免疫細(xì)胞中的組蛋白脫乙?；?調(diào)節(jié)宿主的能量代謝、上皮屏障免疫等生理過(guò)程。SCFA包括乙酸、丙酸、戊酸和丁酸,均來(lái)自結(jié)腸中膳食纖維的微生物發(fā)酵,是結(jié)腸細(xì)胞的主要能源。在對(duì)PD患者腸道代謝產(chǎn)物研究中發(fā)現(xiàn),PD患者與正常對(duì)照組間短鏈脂肪酸存在差異[37]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠類(lèi)固醇激素合成信號(hào)通路表達(dá)也下降,有研究表明類(lèi)固醇激素對(duì)大腦發(fā)育、認(rèn)知、記憶、決策及防止抑郁癥起著重要作用[38]。而腸道菌群可以通過(guò)不同的降解和活化途徑來(lái)影響某些激素的水平,例如雄激素和雌激素。研究表明雌激素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞具有抗炎作用,并且由于微生物群落改變而引起的雌激素水平降低似乎會(huì)增加認(rèn)知障礙和慢性炎癥[39]。

綜上所述,本研究主要分析了帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠機(jī)會(huì)致病菌增多而有益菌減少,表明轉(zhuǎn)基因小鼠存在菌群失調(diào),在應(yīng)用相關(guān)模型時(shí)應(yīng)當(dāng)予以考慮。同時(shí)轉(zhuǎn)基因模型小鼠與野生型小鼠代謝通路存在差異,這將為后期側(cè)重于研究這些代謝通路對(duì)帕金森病的影響提供理論依據(jù)。