熒光定量PCR鑒定胃酶種屬來源質(zhì)控方法研究

潘莎莎 郭睿 楊健 宋博 黃濤 李幸 朱棟 徐燕妮 戎春燕 汪慶燕 周翔

（常州千紅生化制藥股份有限公司 江蘇常州 213125）

1 前言

胃酶由胃部的胃粘膜主細(xì)胞分泌的胃蛋白酶原在pH 1.5～5.0條件下活化而成，可將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段。從豬、羊或牛的胃黏膜中提取的胃酶，均為白色或淡黃色的粉末，國內(nèi)生化藥廠常將其單獨(dú)制成胃酶片或復(fù)方制劑，用于治療消化不良、食欲不振等疾病。國家對于生化藥品的原材料來源進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定，要求選擇生化藥品的原材料時需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定原材料的種屬和器官組織類別，同時選取的原材料必須具有一定的代表性[1]。根據(jù)相關(guān)要求，本文選擇豬、牛、羊（包括綿羊和山羊）作為研究物種，通過設(shè)計針對這些物種基因的胃酶檢測方法來確定胃酶種屬來源。

本次研究主要依賴種屬鑒別實(shí)驗(yàn)，圍繞專屬性和耐用性方面的問題，建立基于熒光定量PCR的方法來對胃酶種屬來源開展質(zhì)控研究，理論依據(jù)主要來自《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》（中國藥典2015年版四部通則9101）等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范和醫(yī)學(xué)要典[2]。

2 方法原理

本次實(shí)驗(yàn)的主要目的在于探究胃酶種屬來源問題。本文根據(jù)種屬不同則基因序列不同這一基本原理，通過引物和探針并結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來提取待研究物種基因組特有的基因序列并進(jìn)行適度擴(kuò)增，通過研究擴(kuò)增曲線及未知樣品的Ct值與起始模板拷貝數(shù)的數(shù)量對應(yīng)關(guān)系來確定未知樣品初始模板基因數(shù)量。

3 儀器與試劑

主要儀器為7500 Fast型實(shí)時定量PCR儀，檢測器見表1。

表1 主要檢測器

供試品主要是胃酶和基因標(biāo)準(zhǔn)品，其中胃酶采購自某生物制藥有限公司，基因標(biāo)準(zhǔn)品主要是豬基因、?；蚝脱颍êd羊和山羊）基因；胃酶、基因標(biāo)準(zhǔn)品、純化水和PCR試劑預(yù)制劑。

試劑盒是由Takara公司提供的DNAiso Reagent型。

為便于使用和標(biāo)記，分別對采購自某生物公司的引物和探針做了編號，見表2。

表2 引物探針序列

4 測試方法

4.1 溶液配制

首先進(jìn)行溶液配制包括基因提取液和上下游引物與探針溶液。

基因提取液的配制比較簡單，主要是將供試品（酌量，本次實(shí)驗(yàn)中取25 mg為宜）和DNSiso Reagent（酌量，本次實(shí)驗(yàn)中取1 ml為宜）進(jìn)行混合，并充分振蕩，然后利用離心機(jī)在室溫條件下將組織裂解液（10 000xg）進(jìn)行離心操作10 min，并將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，至此裂解液中的組織碎片、RNA和多糖類成分基本都能被過濾出去。然后將DNAiso Reagent 1/2體積量的無水乙醇加入到裂解液中，進(jìn)行搖勻操作，直到出現(xiàn)云霧狀的DNA沉淀為止，這時使用槍頭將DNA纏繞出來轉(zhuǎn)移至新的離心管中，將DNA沉淀留在離心管底部。接著將75%乙醇（1 ml）沿離心管壁加入到離心管中，進(jìn)行搖勻操作，在室溫下離心5 min后將乙醇棄去，然后將基因組的DNA在室溫下沉淀5～15 s，緩慢加入滅菌水溶解基因組DNA。

除了基因提取液，還需要配制上、下游引物與探針溶液。首先對上下游引物和探針溶液進(jìn)行密封離心處理，離心處理完畢后，加入純化水進(jìn)行稀釋，稀釋到標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的濃度即行停止，留待他用。

進(jìn)行各基因組標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋時，向標(biāo)準(zhǔn)品原液中加入無核酸純化水，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中對應(yīng)的溶液刻度進(jìn)行稀釋，直到達(dá)到相應(yīng)的濃度刻度值位置。其中，豬基因濃度有5個數(shù)量級，分別是6 000、600、60、6和3 pg/μL，牛和羊基因濃度對應(yīng)著也有5個數(shù)量級，分別是6 000、600、60、0.6和0.3 pg/μL。

此外，還需要準(zhǔn)備能夠?qū)⒒驖舛瓤刂圃?5～100μg/mL的供試品溶液，以及濃度為6 ng/μL的豬基因溶液、濃度為0.06 ng/μL的?；蛉芤骸舛葹?.06 ng/μL的綿羊基因溶液和濃度為0.06 ng/μL的山羊基因溶液。

4.2 測試程序

首先需要對20μL PCR體系進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐渲茫饕遣捎?μL的DNA模板（DNA標(biāo)準(zhǔn)品或樣品或陰性空白溶液）與1μL的上游引物溶液（5μmol/L，終濃度是250 nmol/L）以及1μL的下游引物溶液（5 μmol/L，終濃度是250 nmol/L）進(jìn)行混合，混合完畢后進(jìn)行離心處理，離心完畢后依次加入20μL的純化水、1μL的探針溶液（2μmol/L，終濃度是100 nmol/L），最后再加入10μL的PCR試劑預(yù)混液。然后，安裝相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范中的要求，設(shè)置PCR反應(yīng)條件，具體見表3。

表3 PCR反應(yīng)條件

4.3 數(shù)據(jù)分析

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并采集到相關(guān)數(shù)據(jù)之后，需要利用這些數(shù)據(jù)對系統(tǒng)的適用性、專屬性和耐用性進(jìn)行分析和判斷。首先需要對照標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的刻度值，將各種不同濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Ct值擴(kuò)增，直到達(dá)標(biāo)為止；然后利用比較結(jié)果計算擴(kuò)增效率，確保擴(kuò)增效率在90%～110%（即標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率應(yīng)為-3.1～-3.6）范圍內(nèi)時，表示系統(tǒng)適用性符合要求。專屬性判斷主要是利用上下游引物和探針對豬（6 ng/μL）、牛（0.06 ng/μL）、羊（含綿羊和山羊，均為0.06 ng/μL）的基因組標(biāo)準(zhǔn)品和純化水（即為無模板陰性對照）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用擴(kuò)增后的數(shù)據(jù)計算擴(kuò)增效率。當(dāng)擴(kuò)增效率符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定時，表示基因?qū)傩赃_(dá)到了要求；耐用性判斷主要是將供試品在室溫下放置0 h、2 d、4 d、6 d之后，利用陰性對照（空白溶液）和陽性對照（6 ng/μL豬基因標(biāo)準(zhǔn)品溶液）作為對照組進(jìn)行對比。當(dāng)對比數(shù)據(jù)符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定時，表示耐用性符合要求。

5 結(jié)果

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液系統(tǒng)適用性

對不同種屬的DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增得到與Ct值相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率計算，結(jié)果如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率計算結(jié)果

5.2 專屬性

采用引物P-F、P-R、P-P、B-F、B-R、B-P、O-F、O-R、O-P、C-F、C-R、C-P對豬（6 ng/μL）、牛（0.06 ng/μL）、綿羊（0.06 ng/μL）、山羊（0.06 ng/μL）的基因組標(biāo)準(zhǔn)品和純化水（陰性對照）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見表4。各探針針對其特異性基因組模板的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，針對其它基因組模板和純化水的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

表4 專屬性檢測結(jié)果

5.3 耐用性

利用不同的探針，對各組溶液的Ct值進(jìn)行耐用性檢測，分不同時間段進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。

表5 耐用性檢測結(jié)果

6 結(jié)論

本文設(shè)計了胃酶種屬來源鑒定試驗(yàn)，采用不同原材料的基因組進(jìn)行了相關(guān)測試，并對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明對于判斷胃酶種屬來源提供了支撐，說明了本文實(shí)驗(yàn)方法的正確性。因此，本文設(shè)計的方法可以在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行推廣。