蒙古扁桃不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

吳 桐，周紅兵，王 佳，常 虹，白萬(wàn)富，權(quán)博文，郝海梅，白迎春,*，石松利,*

（1.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.弘慈醫(yī)療集團(tuán)包鋼三醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014010）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝臟對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是慢性肝病共有的病理改變[1]。它是肝硬化及各種終末期肝病復(fù)雜病癥如肝門(mén)靜脈高壓、肝腹水、合成功能紊亂、代謝能力受損等發(fā)生的基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，但也是其早期可逆階段[2]。目前針對(duì)肝纖維化的治療如秋水仙堿、皮質(zhì)類(lèi)固醇等經(jīng)典藥物存在較高的副反應(yīng)發(fā)生率，制約了肝纖維化的治療[3]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)中藥在治療肝纖維化方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[4?6]，中藥治療肝纖維化已成為人們研究的熱點(diǎn)[7]。

蒙古扁桃（Amygdalus mongolica）蒙名烏蘭-布衣勒斯屬薔薇科扁桃屬旱生落葉灌木，為蒙古高原特有的阿拉善荒漠種[8?10]，其分布區(qū)阿拉善荒漠區(qū)是我國(guó)八大生物多樣性中心之一，特殊的環(huán)境脅迫造成了次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性，也為獲得高效低毒的藥用生物活性成分提供了新的來(lái)源[11]。蒙古扁桃富含總黃酮、蛋白質(zhì)、脂肪酸、有機(jī)酸、多糖、維生素E 等營(yíng)養(yǎng)和藥用成分[12]。蒙古扁桃作為一味傳統(tǒng)的中藥材以種仁入藥，可代“郁李仁”[13]，性苦，味平，主治咽喉干燥、干咳及支氣管炎、陰虛便秘，能潤(rùn)燥滑腸、利尿，主治大便燥結(jié)、水腫、腳氣等癥[14]。課題組前期研究表明，蒙古扁桃油具有調(diào)血脂、提高肝臟抗氧化功能和保護(hù)肝臟的作用[15?17]，已證實(shí)蒙古扁桃具有較好防治肝、肺、腎纖維化的作用，并已明確蒙古扁桃石油醚提取物和正丁醇提取物為抗腎纖維化和抗肺纖維化作用有效部位[18?19]，但其抗肝纖維化作用的有效部位有待進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)建立穩(wěn)定的大鼠肝纖維化模型，灌胃蒙古扁桃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物，通過(guò)對(duì)大鼠生理指標(biāo)、肝臟組織的形態(tài)學(xué)、纖維化指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、組織生化指標(biāo)及分子生物學(xué)等方面的分析，篩選出蒙古扁桃對(duì)大鼠肝纖維化保護(hù)作用的有效部位，為進(jìn)一步挖掘蒙古扁桃藥材新的藥理作用及開(kāi)發(fā)治療抗纖維化藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙古扁桃藥材 蒙古扁桃種子采自阿拉善雅布來(lái)戈壁，經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院石松利教授鑒定為蒙古扁桃（Amygdalus mongolica）；水飛薊素膠囊（批號(hào)131102819） 德服博士大藥廠；CCl4（批號(hào)：20091217） 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；ALT、AST 和ALP 試劑盒 美國(guó)貝克曼公司；MDA 試劑盒（批號(hào)：20150421）、SOD 試劑盒（批號(hào)：20150505）、HYP 試劑盒（批號(hào)：20150527）、總蛋白定量測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20150519） 南京建成生物工程研究所；HA 試劑盒、LN 試劑盒、PC-Ⅲ試劑盒、Col-Ⅳ試劑盒（批號(hào)：20151020） 北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；mRNA 提取試劑TRIzol Thermo Fisher Scientific 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑RealSYBR Mixture 康為世紀(jì)公司；PCR 引物 寧夏科諾嘉華生物工程有限公司。SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量170～200 g（許可證號(hào)SCXK（京）2011-0012） 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部）。

TGL-16M 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；GENIUS 5K-D 全自動(dòng)脫帽離心機(jī) 長(zhǎng)沙鑫奧儀器；AU640 全自動(dòng)生化分析儀日本奧林巴斯公司；CX31 顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Vlultifuge X1R 高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛公司；7500 型qPCR 儀 美國(guó)AB 公司；NanoDrop 2000 微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛公司；7500 型qPCR 儀 美國(guó)AB 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒙古扁桃不同極性部位提取物的制備 取蒙古扁桃生藥研碎，置于索氏提取器中，用10 倍體積的95%乙醇（v/v）水浴提取3 次，每次2 h；再用10倍體積的50%乙醇（v/v）提取3 次，每次2 h，得粗提液[20]。分別使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和水浴鍋濃縮粗提液至膏狀。將粗膏依次分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取得到各部位提取物，得率分別為石油醚部位56.68%、乙酸乙酯部位8.38%、正丁醇部位23.35%、水部位11.59%。

1.2.2 建立動(dòng)物模型、分組及給藥 將70 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、纖維化模型組、水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組及蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位提取物7 組，每組10 只。大鼠肝纖維化造模方法參照文獻(xiàn)[21?23]，用橄欖油將CCl4配制成40%橄欖油液，除對(duì)照組之外，其余各組大鼠按體重腹部皮下注射40% CCl4橄欖油液3 mL/kg（首次5 mL/kg），每周2 次，持續(xù)8 周。造模同時(shí)給藥，蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位提取物組給藥劑量均為1.5 g/kg（生藥劑量），以0.01 g/mL 的水飛薊素溶液按大鼠體重5 mL/kg灌胃給藥，模型組和正常對(duì)照組按大鼠體重5 mL/kg灌胃給蒸餾水，每天灌胃1 次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天注意觀察大鼠的反應(yīng)、飲水飲食、糞尿排泄、毛發(fā)光澤等基本情況。

1.2.3 血清及肝臟的采集 末次給藥禁食不禁水24 h后，稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，血液以4 ℃下，以6000 r/min 冷凍離心，分離血清，置于?80 ℃冰箱保存，用以檢測(cè)各項(xiàng)血清生化指標(biāo)。各組大鼠處死后取其肝臟、脾，觀察肝脾色、質(zhì)、形態(tài)等情況，稱(chēng)質(zhì)量用于計(jì)算肝脾指數(shù)和脾指數(shù)（肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量×100%），從肝右葉中相同部位切取肝組織一塊做蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE 染色）、馬松染色（Masson 染色）。

1.2.4 觀察各項(xiàng)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.2.4.1 HE 及Masson 膠原染色觀察肝臟病理學(xué)形態(tài) 將經(jīng)福爾馬林溶液固定后的肝臟組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片進(jìn)行HE 及Masson 膠原染色，于光鏡下觀察（×100）各組大鼠肝臟的肝纖維化程度[24?25]。

1.2.4.2 生化指標(biāo)測(cè)定 血清ALT、AST、ALP、SOD、MDA 含量組織中的SOD 和MDA 均采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀測(cè)量。

1.2.4.3 肝纖維化指標(biāo)測(cè)定 血清中HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA 法），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；肝組織中HYP 的測(cè)定，按照試劑盒方法測(cè)定。

1.2.4.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn) 引物序列如表1：

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：

50 μL 反應(yīng)體系：2×RealSYBR Mixture 25 μL，F(xiàn)orward Primer 10 μmol/L 1 μL，Reverse Primer 10 μmol/L 1 μL，Template DNA 2 μL，ddH2O Up to 50 μL。

qPCR 實(shí)驗(yàn)參數(shù)：

擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s，n=10），采用單因素方差分析對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠一般情況

結(jié)果見(jiàn)表2，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，蒙古扁桃各極性部位組大鼠的體質(zhì)量升高，差異有顯著性（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組大鼠情況良好。各造模組大鼠第2 周開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，食量減少，背毛脫落，皮膚潰爛等情況。給藥期間，水飛薊素組、蒙古扁桃藥材各部位提取物治療組大鼠進(jìn)食、皮毛、活動(dòng)等情況有所改觀。第8 周，處死大鼠時(shí)觀察到正常對(duì)照組大鼠肝臟顏色鮮紅，質(zhì)嫩；模型組大鼠肝臟表面顏色褐色，質(zhì)硬，有花斑樣改變，個(gè)別大鼠肝臟顆粒樣變嚴(yán)重；各給藥組較模型組變化輕。

表2 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on rat body quality

2.2 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝指數(shù)和脾指數(shù)的影響

結(jié)果見(jiàn)表3，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的肝、脾指數(shù)均明顯升高，差異有顯著性（P<0.05）。與模型組比較，蒙古扁桃石油醚、水部位均能明顯降低大鼠的肝指數(shù)，降幅分別為11.11%和14.49%，差異有顯著性（P<0.05）。水飛薊素及蒙古扁桃各部位給藥組均有降低大鼠的脾指數(shù)趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。郭羽軒[26]研究結(jié)果表明睡蓮花總黃酮高劑量組能極顯著降低大鼠肝臟指數(shù)（P<0.01）；睡蓮花總黃酮低、中和高劑量組均能顯著降低肝纖維化大鼠的脾臟指數(shù)（P<0.05）；睡蓮花總黃酮低、中劑量組均能顯著增加大鼠體質(zhì)量（P<0.05），睡蓮花高劑量組能極顯著增加大鼠體質(zhì)量（P<0.01）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒙古扁桃石油醚和水部位具有明顯下調(diào)肝指數(shù)的作用。

表3 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)的影響Table 3 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on rat liver index and spleen index

2.3 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝功能 ALT、AST、ALP 的影響

由表4可知，與正常對(duì)照組比較，模型組血清ALT，AST 和ALP 活力明顯升高，差異有顯著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受損。與模型組比較，蒙古扁桃正丁醇部位能顯著降低血清ALT 活力（P<0.05）；蒙古扁桃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位能顯著降低血清AST 活力（P<0.05），降幅分別為26.99%、55.54%和55.91%；蒙古扁桃石油醚、正丁醇、水部位及水飛薊素能降低血清ALP 活力（P<0.05），降幅分別為32.75%、36.61%、27.66%和42.09%。陳淳[27]研究結(jié)果表明，紅背葉根乙醇、正丁醇提取物能極顯著降低肝纖維化大鼠血清ALT 和AST 水平（P<0.01）。本結(jié)果提示蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明顯改善AST 和ALP活力作用，對(duì)肝纖維化大鼠肝功能起到保護(hù)作用，且蒙古扁桃正丁醇部位效果更佳。

表4 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠血清ALT，AST，ALP 的影響Table 4 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on ALT,AST and ALP in rat serum

2.4 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中HYP 的影響

結(jié)果見(jiàn)表5，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中的HYP 含量明顯升高，差異有顯著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受損。與模型組比較，蒙古扁桃石油醚部位、正丁醇部位和水飛薊素組大鼠肝組織中的HYP 含量降低，差異有顯著性（P<0.05），降幅分別為36.42%、38.85%和38.17%；蒙古扁桃乙酸乙酯和水部位組大鼠肝組織中的HYP 含量有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P>0.05）。結(jié)果提示蒙古扁桃石油醚和正丁醇部位有明顯改善HYP 的作用，在實(shí)驗(yàn)劑量和時(shí)間內(nèi)恢復(fù)HYP 含量接近正常對(duì)照組水平，且蒙古扁桃正丁醇部位效果更佳。

表5 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠肝組織 HYP 的影響Table 5 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on HYP of liver tissue in rats

2.5 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

HE 染色結(jié)果如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞大小均勻，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞變性及壞死現(xiàn)象。模型組的大鼠多數(shù)小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，干細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變，肝臟匯管區(qū)和小葉間有膠原纖維沉積，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠肝纖維化模型。與模型組比較，蒙古扁桃各部位給藥組和水飛薊素組的大鼠肝組織損傷明顯減輕，肝細(xì)胞脂肪變性及壞死顯著減少，細(xì)胞炎癥明顯減輕。

圖1 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響(HE 染色，×100)Fig.1 Effects of different polar regions of Amygdalus mongolica on liver histopathology in rats with liver fibrosis（HE staining，×100）

Masson 染色結(jié)果如圖2所示：正常對(duì)照組的大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，僅在匯管區(qū)有少量膠原纖維存在。模型組的大鼠肝臟匯管區(qū)周?chē)案涡∪~之間有大量粗大的膠原纖維增生，呈寬帶狀增生的膠原纖維形成條索狀纖維分隔，導(dǎo)致正常的肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成了假小葉。蒙古扁桃各給藥組的大鼠肝組織中膠原纖維明顯減少，病變減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)有不同程度的恢復(fù)正常，且以蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位組恢復(fù)較為顯著。

圖2 蒙古扁桃不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響（Masson 染色，×100）Fig.2 Effects of different polarity of Amygdalus mongolica on liver histopathology in rats with liver fibrosis (Masson staining,×100)

2.6 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)血清及肝臟組織MDA、SOD 的影響

結(jié)果見(jiàn)表6，與正常對(duì)照組比較，模型組的大鼠血清中SOD 含量明顯下降，血清及組織中MDA 含量明顯升高，差異有顯著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠過(guò)氧化，引起肝功能受損。與模型組比較，蒙古扁桃各部位給藥組和水飛薊素組血清SOD 含量明顯升高，差異有顯著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位增幅為最高33.14%；蒙古扁桃各部位給藥組和水飛薊素組血清及組織中 MDA 含量明顯降低，差異有顯著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位組血清和組織中MDA 的降幅分別高于其他組，降幅分別46.01%和73.23%。蒙明瑜[28]研究結(jié)果表明，劍葉耳草乙酸乙酯、正丁醇和水部位能降低肝纖維化小鼠織中MDA 活性（P<0.05）和升高SOD 活性（P<0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蒙古扁桃各給藥組均有明顯抗氧化功能，能改善SOD 和MDA 的水平，且以蒙古扁桃石油醚部位效果更佳。

表6 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠血清及肝組織中 SOD、MDA 的影響Table 6 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on SOD and MDA in serum and liver tissues of rats

2.7 蒙古扁桃不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠血清中纖維化指標(biāo)的影響

結(jié)果見(jiàn)表7，與正常對(duì)照組比較，模型組血清HA、PC-Ⅲ和Col-Ⅳ水平升高，差異有顯著性（P<0.05），表明采用四氯化碳造模能使大鼠的肝功能受損。與模型組比較，蒙古扁桃各部位提取物組和水飛薊素組血清中的HA 明顯降低，差異有顯著性（P<0.05），其中水飛薊素組降幅為最高54.88%；蒙古扁桃石油醚部位、正丁醇部位和水飛薊素組PC-Ⅲ明顯降低，差異有顯著性（P<0.05），降幅分別為49.54%、66.67%和11.52%；蒙古扁桃各部位和水飛薊素組血清中的Col-Ⅳ有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性（P>0.05）；結(jié)果提示蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位具有明顯改善肝纖維化大鼠HA 和PC-Ⅲ的作用。

表7 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)大鼠血清肝纖維化指標(biāo) HA、LN、PC-Ⅲ及 Col-Ⅳ的影響Table 7 Effects of different polar parts of Amygdalus mongolica on serum liver fibrosis indexes HA,LN,PC-Ⅲ and Col-Ⅳ in rats

2.8 蒙古扁桃藥材不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

結(jié)果見(jiàn)表8，與正常對(duì)照組相比，模型組的肝組織TGF-β1、Smad3 mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有顯著性（P<0.05）。與模型組比較，蒙古扁桃各部位和水飛薊素組均可抑制肝纖維化大鼠組織中TGFβ1 表達(dá)水平，差異有顯著性（P<0.05），其中蒙古扁桃水部位降幅為最高64.50%；蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯、正丁醇部位和水飛薊素組可抑制肝纖維化大鼠組織中的Smad3 mRNA 表達(dá)水平，差異有顯著性（P<0.05），其中蒙古扁桃石油醚部位降幅為最高41.30%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒙古扁桃石油醚部位、乙酸乙酯和正丁醇部位均可以調(diào)節(jié)TGF-β1 和Smad3 mRNA 的表達(dá)水平，其抗肝纖維化機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)TGF-β 纖維化通路的調(diào)節(jié)來(lái)起作用的。

表8 蒙古扁桃不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響Table 8 Effects of different polarity of Amygdalus mongolica on TGF-β1/Smad signaling pathway in hepatic fibrosis rats

3 討論與結(jié)論

本論文采用CC14誘導(dǎo)大鼠建立肝纖維化模型，通過(guò)組織病理學(xué)（HE 染色、Mission 染色）、HA、HYP、AST 等生化指標(biāo)及TGF-β1、Smad3、Smad7表達(dá)水平的變化，綜合分析該藥材不同極性部位對(duì)肝纖維化大鼠干預(yù)作用，探討蒙古扁桃藥材抗肝纖維化有效部位并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。四氯化碳是經(jīng)典的肝毒性試劑，是最早和目前使用最廣泛的誘發(fā)肝纖維化的毒劑[29]，因此本文采用了CC14造模方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CCl4致大鼠纖維化模型組血清中ALT、AST、ALP 活性顯著升高，血清中SOD含量顯著下降，血清及組織中MDA 含量顯著升高，致大鼠過(guò)氧化，引起肝功能受損。給予蒙古扁桃不同極性部位干預(yù)后，蒙古扁桃正丁醇部位顯著降低ALT、AST、和ALP 活性，蒙古扁桃石油醚部位顯著降低AST 和ALP 活性，說(shuō)明蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明顯改善AST 和ALP 的作用，對(duì)肝纖維化大鼠肝功能起到保護(hù)作用；蒙古扁桃各極性部位均能顯著提高肝纖維化大鼠血清中的SOD 含量，并顯著降低血清和組織中的MDA 含量，提示蒙古扁桃各極性部位有清除活性氧及抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，能夠拮抗CCl4的毒性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CC14可直接溶解肝細(xì)胞膜，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[30]。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，主要存在于肝細(xì)胞中的ALT、AST、ALP 會(huì)被釋放進(jìn)入血液，表現(xiàn)為血清ALT、AST、ALP 水平升高[31]，因此血清中ALT、AST、ALP 水平可反映肝臟受損的程度[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了大鼠模型組血清中的ALT、AST、ALP 水平顯著升高，而蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位有明顯調(diào)節(jié)AST 和ALP 的水平，對(duì)肝纖維化大鼠肝功能起到了保護(hù)作用。

肝纖維化患者的細(xì)胞外基質(zhì)大量生成并沉積于肝臟，HA、LN、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ是肝臟纖維組織主要基質(zhì)成分，其血清水平可反映肝纖維化嚴(yán)重程度[33]，是反映肝纖維化的靈敏指標(biāo)[31]，羥脯氨酸（HYP）是膠原蛋白中特征性的氨基酸成分，肝組織HYP 含量也可反映纖維化的程度[34]。因此，本實(shí)驗(yàn)著重測(cè)定上述肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)和肝組織中的HYP 含量，研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清中的HA、PC-Ⅲ、Col-Ⅳ含量和肝組織HYP 含量顯著升高，表明引起大鼠肝組織損傷及肝纖維化。給予蒙古扁桃不同極性部位干預(yù)后，蒙古扁桃各部位提取物血清中的HA 含量顯著降低，蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位PC-Ⅲ含量顯著降低，起到減輕大鼠肝細(xì)胞壞死和纖維組織沉積程度作用，說(shuō)明蒙古扁桃藥材石油醚和正丁醇部位是抑制 CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的優(yōu)選有效部位。

為了進(jìn)一步深入探索蒙古扁桃藥材抗纖維化的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究實(shí)驗(yàn)樣品中TGF-β1、Smad3、Smad7 等蛋白的表達(dá)水平，從調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad 信號(hào)通路的角度來(lái)研究其抗纖維化機(jī)制。目前公認(rèn)的肝纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路是研究比較多、是比較深入的一條經(jīng)典肝纖維化通路[29]。TGF-β 共有3種：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中肝臟中含量最高且具有生物活性的是TGF-β1，與受體結(jié)合后活化并將信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)[35?36]。而TGF-β1 作為目前已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)促肝纖維化因子，可通過(guò)Smad 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)進(jìn)而活化肝星狀細(xì)胞（HSC，Hepatic stellate cell），并促使其大量分泌胞外基質(zhì)，該過(guò)程是肝纖維化發(fā)生、進(jìn)展，甚至肝硬化形成的核心，故抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路是緩解肝纖維化的關(guān)鍵[37]。由此可知，TGF-β1 是HSC活化的重要中間體，是最重要的前體。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Schnabl 等向敲除Smad3基因的鼠胃內(nèi)注射CCl4，發(fā)現(xiàn)該敲除鼠的α1 膠原蛋白增加，但是HSC 內(nèi)不能形成TGF-β誘導(dǎo)的Smad 與DNA 結(jié)合形成復(fù)合物，可見(jiàn)Smad3 在HSC 的活化和膠原蛋白合成中起到關(guān)鍵作用[35]。文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路可以明顯減輕肝纖維化的癥狀[38?40]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化體內(nèi)，TGF-β1 和Smad3 的表達(dá)明顯上調(diào)，表明肝細(xì)胞中TGF-β1/Smad 信號(hào)通路被激活，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程，而給予蒙古扁桃藥材干預(yù)后，蒙古扁桃石油醚和正丁醇部位組TGF-β1、Smad3 的表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明蒙古扁桃可以通過(guò)抑制Smad3 的磷酸化水平和TGF-β1 的活性，從而調(diào)控肝星狀細(xì)胞的活性，起到抑制肝纖維化作用，其機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)TGFβ纖維化通路的調(diào)節(jié)來(lái)起到抗纖維化作用。

綜上所述，蒙古扁桃藥材石油醚、正丁醇提取物可以明顯改善肝纖維化大鼠的組織病理學(xué)變化，對(duì)AST、ALP、SOD、MDA 等指標(biāo)和纖維化四項(xiàng)指標(biāo)HA、PC-Ⅲ的水平及HYP 水平有明顯改善作用，并對(duì)TGF-β1、Smad3 水平有顯著改善作用，說(shuō)明該藥材具有明確地抗肝纖維化作用。蒙古扁桃藥材石油醚、正丁醇提取物是保護(hù)肝纖維化的優(yōu)選活性部位，其抗纖維化作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)膠原合成異常及抑制TGF-β1/Smad 信號(hào)通路作用有關(guān)。