阿拉伯半乳聚糖對(duì)2型糖尿病大鼠腸道堿性磷酸酶、細(xì)菌內(nèi)毒素和腸道中細(xì)胞因子的影響

王語(yǔ)聰，謝智鑫，張學(xué)艷，趙太云，Vladimir Ostronkov，Lokhov Dmitrii，韓建春,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150030；4.軍科正源（北京）藥物研究有限責(zé)任公司，北京 102200；5.俄羅斯阿美提斯公司，俄羅斯阿穆?tīng)栔?675000；6.俄羅斯基本元素公司，俄羅斯阿穆?tīng)栔?675000）

在我國(guó)2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增趨勢(shì)[1]，目前糖尿病的治療方法主要包括口服抗糖尿病藥物和注射胰島素。然而，連續(xù)使用這些藥物會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和副作用。因此，有效、無(wú)毒和負(fù)擔(dān)得起的藥物是糖尿病患者需求迫切。近年研究表明，糖尿病特征之一就是炎性反應(yīng)，這與脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）增多有關(guān)[2]。大量LPS 進(jìn)入血液循環(huán)后誘發(fā)細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而引起炎癥失衡，導(dǎo)致胰島素抵抗（IR）和最終誘發(fā)2 型糖尿病，現(xiàn)已證明此作用為“代謝性內(nèi)毒素血癥”[3]。由于LPS 是腸道堿性磷酸酶（Intestinal Alkaline Phosphatase,IAP）的底物，因此，IAP 可以通過(guò)對(duì)革蘭氏陰性菌產(chǎn)生內(nèi)毒素進(jìn)行去磷酸化作用來(lái)保護(hù)細(xì)胞[4]，從而降低炎癥發(fā)生。此外，Bates 等[5]探究了腸道炎癥中LPS 和IAP 的動(dòng)態(tài)平衡反饋機(jī)制，發(fā)現(xiàn)LPS 經(jīng)IAP 去磷酸化后便不能有效刺激TKR4受體；此外，當(dāng)炎癥和細(xì)菌跨粘膜通道增加后，細(xì)胞內(nèi)IAP 可阻止NFkB 途徑的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白磷酸化，達(dá)到阻止NFkB 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核的目的。因此，IAP與LPS 呈負(fù)相關(guān)且對(duì)炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。

近年來(lái)，阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan，AG）的免疫調(diào)節(jié)活性研究廣泛，作為新型食品被熟知。阿拉伯半乳聚糖是一類中性多糖，由阿拉伯糖和半乳糖組成[6]，主側(cè)鏈分別是半乳聚糖和阿拉伯糖。AG 在自然界中分布廣泛，主要存在于植物性食物中，在落葉松木質(zhì)部中存在含量高達(dá)25%[7?8]。除此之外，2002年6月，美國(guó)食品藥品監(jiān)督局通過(guò)將AG 作為食品添加劑廣泛應(yīng)用到飲料和日常食品中，使其作為膳食補(bǔ)充，具有廣闊的前景。有研究表明，AG 具有抗炎、調(diào)節(jié)腸道、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)等作用。Yang 等研究從稻殼中提取的AG 能夠有效地降低結(jié)腸癌CT26 小鼠模型的腫瘤重量和體積，并且顯著上調(diào)脾臟細(xì)胞毒性和natural killer（NK）細(xì)胞數(shù)量，說(shuō)明AG 能夠增強(qiáng)NK 細(xì)胞的活化能力從而具有抗腫瘤作用[9]。Wu 等研究了從榕果殼中提取的AG 具有免疫調(diào)節(jié)活性，能夠促進(jìn)NO 的產(chǎn)生、吞噬活性以及白介素等細(xì)胞因子的分泌，且不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性[10]；WANG 等探究從山茶葉中分離出水溶性AG 名為7WA，通過(guò)上調(diào)GLP-1R、PKA、PDX-1、INS-1、INS-2、GLUT2 和GCK 的mRNA轉(zhuǎn)錄以及PDX-1 蛋白的表達(dá)，通過(guò)cAMP-PKA 途徑促進(jìn)RIN-5F 細(xì)胞胰島素的分泌[11]，說(shuō)明AG 具有促進(jìn)胰島素分泌的功能；Naik 等研究了黑豆中AG 對(duì)小鼠急性損傷模型保肝作用研究，結(jié)果表明通過(guò)提升血清中IAP 活性來(lái)提高肝臟抗氧化性來(lái)保護(hù)肝組織[12]。因此，我們推測(cè)AG 可能通過(guò)提升IAP活性抵抗T2DM。

綜上，AG 具有調(diào)節(jié)機(jī)體腸道、機(jī)體和抗炎等活性，但是否具有緩解2 型糖尿病潛力及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本試驗(yàn)以T2DM 大鼠為模型，通過(guò)灌胃AG，檢測(cè)大鼠體質(zhì)量變化和血糖濃度變化，探究AG 通過(guò)對(duì)IAP 活力和LPS 濃度的影響，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞因子水平[白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1β）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α（KC/GRO）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）]的變化，為AG 在功能性食品開(kāi)發(fā)利用、營(yíng)養(yǎng)調(diào)配和疾病治療等領(lǐng)域提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)別SD 雄性大鼠（150±20 g，合格證：No.1103241911038497） 北京斯貝福生物有限公司；阿拉伯半乳聚糖 純度99%，河北豐味生物科技公司；鏈脲佐菌素（STZ） 美國(guó)Sigma 公司；P0321堿性磷酸酶試劑盒型號(hào) 碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司；EC80545S 內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒 廈門試劑生物科技責(zé)任有限公司；K15059D Proinflammatory Panel 2 (rat) Kits Meso Scale Diagnostics LLC 公司；AIN-93M 標(biāo)準(zhǔn)飼料（NMF，總熱能3601 kcal/kg，10%的能量為脂肪和14.1%的能量為蛋白質(zhì)） 中國(guó)營(yíng)養(yǎng)動(dòng)物飼料高科技有限公司；高糖高脂飼料（1.5%膽固醇、0.25%膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、83.25%標(biāo)準(zhǔn)飼料） 中國(guó)營(yíng)養(yǎng)動(dòng)物飼料高科技有限公司

HERAEUS Multifuge X3R 離心機(jī) 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；1300 MESO? QuickPlex SQ 120 Meso Scale Diagnostics MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT?微孔板 LLC 公司；1300 MESO?QuickPlex SQ 120 Meso Scale Diagnostics 讀板機(jī)LLC 公司；I14698I 血糖測(cè)定儀 強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù) 將大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物籠中，并保持50%±15%濕度，22±2 ℃溫度和晝夜12 h條件下單籠飼養(yǎng)。所有試驗(yàn)程序遵循動(dòng)物倫理委員會(huì)試驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南（第8 版），ISBN-10：0-309-15396-4[13]。將大鼠分成4 組（n=10）并投喂標(biāo)準(zhǔn)飲食及高糖高脂飼料。第1 組正常對(duì)照組：未經(jīng)處理，每日給予標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂并灌胃20 mL/kg 超純水；第2 組模型組：喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg超純水；第3 組AG 低劑量組：喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg AG 劑量為100 mg/（kg·d）溶劑；第4組AG 高劑量組：喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg AG 劑量為500 mg/（kg·d）溶劑。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，Groman 等人探究AG 對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)，研究表明經(jīng)口服給予SD 大鼠20 g/kg 的AG后未出現(xiàn)中毒及死亡現(xiàn)象。此外，此團(tuán)隊(duì)還進(jìn)行為期90 d 的毒性試驗(yàn)，通過(guò)靜脈注射給予大鼠500 mg/kg的AG 后并未造成任何不良影響。因此本實(shí)驗(yàn)劑量選取為100 和500 mg/kg。試驗(yàn)期間大鼠自由采食和飲水，每天早上八點(diǎn)定時(shí)灌胃，在建模成功后第4 周犧牲并進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。

在14 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)后，開(kāi)始建立2 型糖尿病大鼠模型。除正常對(duì)照組外，其余組均高糖高脂飼料喂養(yǎng)3 周。將模型組和AG 劑量組給予30 mg/kg STZ腹腔注射（禁食12 h），續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料；注射后第3 d 和第7 d（禁食12 h），檢測(cè)空腹血糖值，選取空腹血糖值≥11.1 mmol/L 的大鼠為造模成功的大鼠，以大鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L 為依據(jù)建立模型[15?16]。在對(duì)STZ 粉劑進(jìn)行計(jì)算時(shí)，以30 mg/kg 為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液中（0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液，pH4.3）。為保證其特性，應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，并避光保存。

1.2.2 小腸組織和糞便采集及制備 腸液在禁食8 h后通過(guò)腹部注射20%烏拉坦按4 mL/kg 劑量對(duì)大鼠麻醉，隨后頸部脫臼處死大鼠，將處死后大鼠固定在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行解剖。將小腸按近胃部幽門處2～3 cm 開(kāi)始剪取一段腸道組織，所需組織經(jīng)過(guò)在濾紙上吸取表面水分和污垢后稱量，稱取0.2 g 組織樣本。將稱量好的0.2 g 小腸組織放入呈有5 mL 預(yù)冷的PBS 溶液的組織勻漿器中，使用組織勻漿器將組織粉碎完全，立即裝入15 mL 離心管中、于2000×g離心10 min，吸取上清液，置于1.5 mL EP 管中，?20 ℃冷凍保存。

試驗(yàn)開(kāi)始后采取2 粒大鼠糞便于EP 管中放在?20 ℃儲(chǔ)存。用于檢測(cè)糞便中堿性磷酸酶和細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

1.2.3 大鼠體重和血糖檢測(cè) 開(kāi)始條件喂養(yǎng)后，每周進(jìn)行尾靜脈采血用血糖儀測(cè)定空腹血糖（Fasting blood glucose，F(xiàn)BG），并稱量體重。

1.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定 取少量糞便，加入一定比例細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水（本試驗(yàn)1:10），迅速3000×g 離心1 min 收集上清液，OD 值為545 nm，利用試管定量顯色基質(zhì)法檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素濃度[17]。

1.2.5 堿性磷酸酶測(cè)定 取1 mg 糞便，加入50 μL PBS 溶液進(jìn)行稀釋，用旋渦法制備糞便勻漿懸液，10000×g 離心20 min 收集含AP 上清液，并根據(jù)堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定AP 活性（此時(shí)AP 活性為IAP 活性）。

1.2.6 細(xì)胞因子含量檢測(cè) 利用MSD 電化學(xué)發(fā)光（ECLA）檢測(cè)技術(shù)，以SULFO‐TAGTM 標(biāo)記物。在MULTI-ARRAY 和MULTI-SPOT?微孔板電極表面通電后，電化學(xué)作用激發(fā)SULFO-TAGTM標(biāo)記物發(fā)出強(qiáng)光，檢測(cè)細(xì)胞因子含量。將待測(cè)腸液進(jìn)行4 ℃ 3000×g 離心5 min，取1 mL 上清液到標(biāo)準(zhǔn)品中，充分振蕩，室溫放置15～20 min。配制檢測(cè)抗體稀釋液，吸取每種因子的檢測(cè)抗體60 μL，并用稀釋液補(bǔ)足至3 mL。配制1×PBS（0.05%吐溫?20）清洗液待用。配制2×讀板液。加入150 μL Blocker H溶液，并用封口膜封上，室溫孵育1 h 后加入50 μL待測(cè)液，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h。加入配制好的25 μL 檢測(cè)抗體，并用封口膜封上，室溫振蕩2 h加入150 μL 溶液，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究通過(guò)Excel、Graphpad Prism8、IBM SPSS Statistics 20 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM），P<0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即差異顯著，P<0.01 即極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體質(zhì)量變化

如圖1所示，在適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后開(kāi)始建模。建模成功后，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，AG 劑量組大鼠體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量隨干預(yù)時(shí)間變化（±s,n=10）Fig.1 Changes in body weight of rats in each group with the time of intervention (±s,n=10)

在整個(gè)過(guò)程中，正常對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，色澤光亮。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠不活潑、頹廢，臟亂，精神狀態(tài)不好，毛色不光澤。在經(jīng)過(guò)灌胃AG 后，劑量組大鼠精神好轉(zhuǎn)，反應(yīng)敏感度加大，頹廢狀態(tài)有所改善，活動(dòng)加多，說(shuō)明AG 緩解了T2DM 帶來(lái)影響。上述結(jié)果表明，正常對(duì)照組大鼠體重明顯高于模型組和AG 劑量組，正常對(duì)照組大鼠通過(guò)正常飲食后體重有所增加，AG 劑量組相對(duì)平穩(wěn)，而模型組在通過(guò)高糖高脂飼料喂養(yǎng)后，體重出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是高劑量STZ 與高熱量飲食聯(lián)合[18]，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生壞死,并致胰島素分泌發(fā)生不足，進(jìn)而使體內(nèi)糖代謝絮亂，發(fā)生胰島素抵抗（IR），大鼠使用體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)提供能量[19]。

2.2 大鼠血糖變化

如表1所示，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行建模，在7 和14 d 時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組有極顯著差異（P<0.01）；與模型組相比，AG 劑量組均無(wú)顯著差異（P>0.05）。在21 d 時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組有極顯著差異（P<0.01）；與模型組相比，AG 低劑量組無(wú)顯著差異（P>0.05），AG 高劑量組有顯著差異（P<0.05）。在28 d 時(shí)，與正常對(duì)照組相比，模型組極顯著上升（P<0.01）；與模型組相比，AG 劑量組均顯著降低（P<0.05）。

表1 AG 對(duì)2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（±s,n=10）Table 1 Effect of arabinogalactan on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (±s,n=10)

表1 AG 對(duì)2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（±s,n=10）Table 1 Effect of arabinogalactan on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (±s,n=10)

注：*表示與正常對(duì)照組相比，P<0.05；**表示與正常對(duì)照組相比，P<0.01；#表示與模型組相比，P<0.05；##表示與模型組相比，P<0.01；表2同。

組別 血糖含量（mmol/L）0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常對(duì)照組 5.6800±0.1302 5.8000±0.1441 5.3000±0.8280 6.2000±0.7010c 5.6000±0.5940模型組 5.9000±0.3106 16.2000±0.7219** 15.0000±2.5700** 15.6000±1.7380** 16.1000±1.7040**AG低劑量組 5.6733±0.1512 16.9000±0.7967 15.7000±1.5220 14.3000±2.5200 12.5000±1.5540#AG高劑量組 5.7500±0.2552 16.5000±3.1240 14.5000±2.7750 13.4000±2.5290# 11.2000±1.7100#

空腹血糖是診斷T2DM 最重要標(biāo)準(zhǔn)，血糖高低標(biāo)志著T2DM 病情改善情況。有研究表明，AG 主要通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌和抑制糖降解酶活性，從而通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)糖的利用和減少淀粉、雙糖的分解多方面作用的結(jié)果而達(dá)到降血糖的目的[20]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，相比于模型組，AG 使T2DM 大鼠降糖效果明顯，說(shuō)明AG 對(duì)T2DM 大鼠有輔助降糖作用。

2.3 糞便中LPS 濃度變化

如表2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組LPS 濃度顯著上升（P<0.05）；與模型組相比，AG 劑量組LPS 顯著降低（P<0.05）。在IAP 方面，與正常對(duì)照組比，模型組極顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，AG 劑量組均極顯著升高（P<0.01）。

表2 AG 對(duì)2 型糖尿病大鼠糞便中IAP 和LPS 影響（±s,n=10）Table 2 Effect of arabinogalactan powder on IAP and IAP in fecal of type 2 diabetic rats (±s,n=10)

表2 AG 對(duì)2 型糖尿病大鼠糞便中IAP 和LPS 影響（±s,n=10）Table 2 Effect of arabinogalactan powder on IAP and IAP in fecal of type 2 diabetic rats (±s,n=10)

組別 LPS（EU/mL） IAP活性（U）正常對(duì)照組 3.664±0.201 87.550±0.387模型組 7.813±0.4364* 31.367±0.469**AG低劑量組 2.270±0.081# 94.668±1.807##AG高劑量組 2.321±0.0329# 95.707±0.388##

為進(jìn)一步揭示AG 對(duì)T2DM 作用機(jī)制，本試驗(yàn)建立了T2DM 大鼠模型。T2DM 主要體現(xiàn)胰島素抵抗及胰島素分泌不足。炎癥與IR 聯(lián)系密切，被認(rèn)為是導(dǎo)致IR 發(fā)生的根源，已有研究表明，腸道慢性炎癥在T2DM 發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，腸道粘膜免疫發(fā)生絮亂，就會(huì)引起腸道炎癥發(fā)生[21]。IAP 是一種腸道刷狀邊界酶，其僅在近端小腸絨毛相關(guān)腸細(xì)胞中表達(dá)，可以作為腸道粘膜防御因子，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保護(hù)宿主免受腸道炎癥損傷，IAP 可以降解LPS，降低其毒性，其原因?yàn)镮AP 使LPS 脫磷酸，失去破壞性，從而解毒[22]。腸道存在大量革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁主要成分是LPS，當(dāng)腸道中LPS 濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞腸道粘膜免疫系統(tǒng)，誘發(fā)腸道炎癥發(fā)生。有證據(jù)表明，T2DM 有利于內(nèi)毒素（特別是LPS）在腸屏障中易位，導(dǎo)致血液中內(nèi)毒素濃度輕微升高[23]。有研究表明正常人糞便IAP 活性要比T2DM 人活性高，糞便中IAP 每降低25 U，糖尿病風(fēng)險(xiǎn)增加35%?？偟膩?lái)說(shuō)，高水平IAP 對(duì)于T2DM 有保護(hù)作用[24]。由鼠高脂肪飲食誘導(dǎo)代謝綜合征和T2DM，已被證明可以通過(guò)口服內(nèi)源性或者外源性（牛）IAP 進(jìn)行治療或預(yù)防[25]。本研究數(shù)據(jù)中表明，AG 可以減少T2DM大鼠糞便中LPS 濃度，AG 劑量組與模型組相比差異降低（P<0.05）。AG 在增加T2DM 大鼠糞便IAP 活性同時(shí)降低LPS 濃度。與Lallès J P 等[26]研究結(jié)果相似，腸道中IAP 和LPS 存在負(fù)相關(guān)，當(dāng)腸腔中IAP 濃度增加時(shí)，對(duì)LPS 作用增加，LPS 所帶毒性就得到減少，濃度降低，LPS 引起腸道炎癥就會(huì)減輕，因此T2DM 大鼠癥狀會(huì)有所改善。

2.4 腸液中細(xì)胞因子含量測(cè)定

2.4.1 促炎因子含量變化 如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型組IL-6、TNF-α和IFN-γ均極顯著升高（P<0.01），IL-1β顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，AG 劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ均極顯著降低（P<0.01）。

圖2 AG 對(duì)大鼠腸液IL-6、IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 濃度的影響（±s,n=10）Fig.2 Arabinogalactan on the concentration of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mouse serum (±s,n=10)

腸道粘膜免疫與T2DM 發(fā)生關(guān)系密切，細(xì)胞因子在腸道粘膜免疫中發(fā)揮重要作用，當(dāng)免疫系統(tǒng)被激活時(shí)，免疫細(xì)胞會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，作為免疫應(yīng)答及炎癥效應(yīng)因子，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。由緊密連接（Tight junction，TJ）相連的腸上皮細(xì)胞，可以阻止病毒微生物侵入到腸道中，當(dāng)TJ 蛋白（ZO-1、Occludin 等）遭到破壞，導(dǎo)致通透性增加，使免疫細(xì)胞模式識(shí)別受體與腸道微生物及其代謝產(chǎn)物中的病原相關(guān)分子模式結(jié)合，免疫細(xì)胞被激活使其分泌炎癥因子，如IL-6、TNF-α、IFN-γ等，這些促炎因子在胰島素靶細(xì)胞作為轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的炎癥介質(zhì)，使胰島素受體底物-1（IRS-1）中絲氨酸磷酸化，因此酪氨酸磷酸化受到抑制，胰島素信號(hào)傳播受到阻礙，產(chǎn)生IR[27]。IL-6 分泌過(guò)多，調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子分泌，會(huì)加快激活殺傷T 細(xì)胞，胰島β細(xì)胞凋亡速度加快；有研究表明T2DM 高血糖可以促進(jìn)TNF-α濃度升高，過(guò)多加速胰島細(xì)胞破壞；高脂喂養(yǎng)的小鼠中腸道中IL-6 分泌增加，TNF-α表達(dá)升高[28]；IL-1β可以作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，在炎癥中發(fā)揮中心作用，增加腸道通透性[29]。Mehdi Tabarsa[30]在口香糖中提取阿拉伯半乳聚糖（FGP）通過(guò)在RAW264.7 細(xì)胞中表達(dá)包括NO、TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-12，NK-92 細(xì)胞中表達(dá)TNF-α、IFNγ、顆粒酶B、穿孔素、NKG2D 和FasL 等多種炎癥介質(zhì)來(lái)激活NF-κB 和MAPKs 免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎反應(yīng)。Yang 等[31]首次研究了來(lái)自臺(tái)灣白背天牛的II型阿拉伯半乳聚糖（AGAF），表明AGAF 通過(guò)IFNγ通過(guò)自分泌效應(yīng)產(chǎn)生和增強(qiáng)細(xì)胞毒性等多種因素機(jī)制誘導(dǎo)IFN-γ表達(dá)伴隨著NK 細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)的細(xì)胞毒性激活。Saman Bahramzadeh[32]在通過(guò)NF-κB 和通過(guò)TLR4 和TLR2 受體啟動(dòng)的MAPKs信號(hào)通路介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)，證明阿拉伯半乳聚糖能有效地刺激RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞釋放大量的包括NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 促炎介質(zhì)。與前人在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，本動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表示，AG 劑量組與模型組IL-6、TNF-α和IFN-γ相比出現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），IL-1β有顯著差異（P<0.05），其可能原因?yàn)锳G 刺激促炎因子受到胰島素抵抗以后分泌速度減慢，導(dǎo)致胰島素細(xì)胞凋亡速度降低，因此能夠證明，AG 可降低相關(guān)炎癥因子濃度，從而緩解炎癥,進(jìn)而緩解T2DM。

2.4.2 抗炎因子含量變化 如圖3所示，與正常對(duì)照組相比，模型組IL-4 和IL-5 極顯著下降（P<0.01），IL-10和IL-13 均顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，AG 劑量組IL-4 和IL-5 極顯著上升（P<0.01），IL-10和IL-13 均顯著上升（P<0.05）。

圖3 AG 對(duì)大鼠腸液IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 濃度的影響（±s,n=10）Fig.3 Arabinogalactan on the concentration of IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13 in mouse serum (±s,n=10)

IL-4 典型抗炎因子，在Th2 細(xì)胞中都具有代表性細(xì)胞因子，可以抑制炎癥因子分泌，包括IL-6、TNF-α等，IL-5 同IL-4 一樣在Th2 細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，可以緩解由嗜酸性粒細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥效應(yīng)，Th2 細(xì)胞屬于抗炎細(xì)胞，起到重要抗炎作用，可以使Th1 介導(dǎo)炎癥受阻[33]；IL-10 是免疫調(diào)節(jié)因子，可以終止炎癥發(fā)生；IL-10 屬于抗炎因子，可以控制炎性反應(yīng)發(fā)生，機(jī)體組織糖、脂肪代謝可以被IL-10 調(diào)節(jié)，起到T2DM 發(fā)生預(yù)防作用。IL-13 可以使巨噬細(xì)胞活化受到抑制，減少炎性因子分泌，可以同時(shí)抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，又可以使B 細(xì)胞增殖加快及分泌抗體，起到抗炎因子作用[34]。William[35]研究結(jié)核分枝桿菌阿拉伯半乳聚糖中發(fā)現(xiàn)，受體誘導(dǎo)抗炎因子IL-10 的分泌，產(chǎn)生抗炎因子IL-4 和IL-13，抑制IL-12并降低其氧化反應(yīng)的激活，起到抑制炎癥的效果；Yang[36]研究多糖對(duì)糖尿病腎病大鼠腎損傷的保健作用中發(fā)現(xiàn)，多糖可能通過(guò)阻斷TGF-β1/Smad 信號(hào)通路，促進(jìn)T 細(xì)胞分化，提高抗炎因子IL-4、IL-10水平，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕DN 大鼠腎臟的損傷程度。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AG 劑量組與模型組相比大鼠腸液IL-4 和IL-5 極顯著上升（P<0.01），IL-10 和IL-13 均顯著上升（P<0.05）。其可能原因是AG 刺激抗炎因子，使其表達(dá)量增加，從而抑制促炎因子的表達(dá)量，并升高抗炎因子濃度，緩解炎癥反應(yīng)，因此，試驗(yàn)結(jié)果表明AG 具有促進(jìn)腸道上皮屏障損傷修復(fù)作用，尤其是對(duì)腸道粘膜免疫作用，進(jìn)而緩解T2DM。

2.4.3 白細(xì)胞介素KC/GRO 含量變化 如圖4表示，與正常對(duì)照組相比，模型組KC/GRO 濃度極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，AG 劑量組KC/GRO 濃度均極顯著降低（P<0.01）。

圖4 AG 對(duì)大鼠腸液KC/GRO 濃度的影響（±s,n=10）Fig.4 Arabinogalactan affects the serum KC/GRO concentration of mice (±s,n=10)

KC/GRO 是趨化因子中的一種，推測(cè)其表達(dá)與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)，與受體結(jié)合后可促進(jìn)炎癥反應(yīng)[29]?？傮w來(lái)說(shuō)，由于攝入高脂肪食物會(huì)導(dǎo)致腸道中LPS 的釋放，破壞腸道粘膜從而刺激炎癥因子的釋放[37]，然而，目前還沒(méi)有對(duì)趨化因子的數(shù)據(jù)支撐。因此，本試驗(yàn)結(jié)果表明AG 能夠有效降低糖尿病大鼠腸液中KC/GRO，進(jìn)而降低促炎因子。其可能的原因是AG 降低LPS 及炎癥因子的濃度從而減少GRO 的表達(dá)，進(jìn)而有效改善T2DM。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)糖尿病模型大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AG 可以維持血糖穩(wěn)定，提高腸道中IAP 活力，有效降低LPS 濃度，調(diào)控大鼠腸道中炎癥因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-10 及IL-13）和KC/GRO 水平，因此AG 能夠有效改善T2DM。其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道中IAP 活力刺激LPS 濃度的變化來(lái)調(diào)控炎癥因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，未來(lái)需要進(jìn)一步研究含有AG 成分的物質(zhì)能否調(diào)控參與改善機(jī)體炎癥及血糖代謝，緩解T2DM 的發(fā)展。