氣相-離子遷移譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法快速區(qū)分不同年份釀造白酒

張敏敏，路巖翔，趙志國，崔 莉，閆慧嬌，王 曉，趙恒強(qiáng),*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測試中心，山東濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南市行政審批服務(wù)局，山東濟(jì)南 250001）

釀造白酒是我國的一種特有酒類，其以古老的釀造工藝和獨(dú)特的風(fēng)味、口感聞名世界，是世界七大蒸餾酒之一[1]。根據(jù)香型不同，釀造白酒可以分為濃香型、清香型、醬香型和芝麻香型等多種類型[2]。其中醬香型白酒以其口味醇厚，余味悠長等特點(diǎn)深受廣大消費(fèi)者喜愛，其中最具代表性的為茅臺酒[3]。醬香型釀造白酒品質(zhì)與其窖藏年份有著重要的聯(lián)系。窖藏年份越久，釀造白酒中的辣味成分減少，酒味漸趨平和、綿柔，酒香較為醇厚、芬芳[4]。自20世紀(jì)90年代“年份酒”概念被引入中國白酒市場后，經(jīng)過窖藏后的“年份酒”更得消費(fèi)者親睞，價(jià)格也相對較高[5]。由于我國缺少關(guān)于釀造白酒年份鑒別的準(zhǔn)則典籍和法律法規(guī)，導(dǎo)致目前“年份酒”市場較為混亂，以次充好、摻假等問題嚴(yán)重侵犯了消費(fèi)者的合法利益[6]。目前，對于白酒的檢測方式一般分為人工評定和理化指標(biāo)檢測兩種[7]。其中，人工評定法易受外界環(huán)境和個(gè)人主觀意識影響，且對評定人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高[8]。理化指標(biāo)檢測一般是利用氣相色譜質(zhì)譜、高效液相色譜等技術(shù)測定其中的某些成分，對實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)儀器的要求較高，且樣品需要預(yù)先進(jìn)行復(fù)雜的前處理實(shí)驗(yàn)，較為繁瑣[9?11]。熒光光譜技術(shù)可以通過多個(gè)樣本建立矩陣實(shí)現(xiàn)樣本的檢測，但前期工作需要人工尋找光譜特征量，預(yù)測準(zhǔn)確性和客觀性有待進(jìn)一步提高，也無法給出具體的化合物定性信息[12?13]。因此，亟需發(fā)展一種釀造酒年份快速檢測的技術(shù)來規(guī)范化年份酒市場。

氣相色譜離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS）作為一種新興的檢測技術(shù)，是一種利用氣相色譜（gas chromatography,GC）結(jié)合離子遷移譜（ion mobility spectroscopy,IMS）對樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行快速檢測的技術(shù)[14]。該技術(shù)是基于復(fù)雜化合物組分經(jīng)過氣相色譜柱的初步分離后，離子化化合物在特定的電場中通過固定的距離（漂移管）所需的漂移時(shí)間不同來實(shí)現(xiàn)的[15]。目前，該項(xiàng)技術(shù)在油類[16?17]、蜂蜜[18?20]、松茸等[21?22]食品摻假等方向已有廣泛應(yīng)用。然而，在醬香型白酒年份快速區(qū)分領(lǐng)域應(yīng)用較為少見。

本研究采用GC-IMS 技術(shù)對醬香型白酒（茅臺）的不同年份樣品（包含老熟樣本）進(jìn)行了初步分析，并通過LAV 軟件快速生成指紋圖譜，結(jié)合主成分分析（principal component analysis,PCA）和主成分-聚類分析（principal component analysis-cluster analysis,PCA-CA）等計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行區(qū)分研究，對所含揮發(fā)性成分進(jìn)行部分鑒別，為釀造白酒年份區(qū)分提供一種新方法、新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同年份醬香型白酒茅臺 1-0（十年原酒）、1-1（十年老熟1 號）、1-2（十年老熟2 號）、1-3（十年老熟3 號），2-0（五年原酒）、2-1（五年老熟1 號）、2-2（五年老熟2 號）、2-3（五年老熟3 號），3-0（兩年原酒）、3-1（兩年老熟1 號）、3-2（兩年老熟2 號）、3-3（兩年老熟3 號） 山東七彩養(yǎng)生健康科技有限公司。

GAS FlavourSpec?氣相離子遷移譜 德國G.A.S.公司；HAMAG 20 mL 磁蓋螺口頂空瓶 浙江哈邁科技；SE-54（30 m×0.32 mm,0.25 μm） 非極性色譜柱 德國CS 色譜服務(wù)技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 分別吸取1.0 mL 白酒樣品置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，加入2.0 mL 水稀釋后封蓋備用。

1.2.2 GC-IMS 實(shí)驗(yàn)條件 GC-IMS 實(shí)驗(yàn)過程中包含兩大部分：樣品孵育過程和進(jìn)樣分析過程。其中進(jìn)樣分析過程又包含氣相色譜柱預(yù)分離和離子遷移譜分離。因此，實(shí)驗(yàn)條件包含孵育條件，GC 條件和IMS 條件三部分，詳見表1。

表1 GC-IMS 實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Test conditions of GC-IMS

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-IMS 得到的直觀實(shí)驗(yàn)結(jié)果為一個(gè)以離子遷移時(shí)間為橫坐標(biāo)，氣相保留時(shí)間為縱坐標(biāo)的揮發(fā)性有機(jī)物點(diǎn)圖。需要對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析來實(shí)現(xiàn)本研究的研究目的。主要包含化合物定性分析，樣品間差異分析，指紋圖譜分析以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析四項(xiàng)。通過G.A.S.公司配置的軟件和內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對樣品中揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行定性；通過LAV 軟件和內(nèi)置的 Gallery plot 插件、PCA analysis插件以及DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成不同樣品的指紋圖譜分析，PCA 分析和PCA-CA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-IMS 條件優(yōu)化

GC-IMS 分析方法是一種將GC 分析和IMS 分析相結(jié)合的二維分析方法，包含樣品富集進(jìn)樣、GC 分離和IMS 分離等過程。合適的實(shí)驗(yàn)條件將大大加快實(shí)驗(yàn)效率和目標(biāo)物的分離度，提高定性準(zhǔn)確率。本研究分別從以下三部分對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化：

樣品孵育過程是一個(gè)樣品中VOCs 的富集過程，孵育溫度和孵育時(shí)間均為該過程中的重要指標(biāo)。在前期類似研究文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[23]，本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了孵育條件對醬香型白酒GC-IMS 分析的影響。優(yōu)化過程中保持孵育時(shí)間為10 min 條件下，考察了40 和60 ℃兩個(gè)不同孵育溫度為唯一變量對樣品的影響，見圖1A，見圖1B。結(jié)果表明，60 ℃下孵育10 min 可得到較多的VOCs 信息。氣體洗脫程序是GC 分析過程中的重要因素，需要進(jìn)行合適的優(yōu)化。影響化合物在GC 柱上保留的主要因素是載氣流速（EPC2）。根據(jù)氣相色譜的特點(diǎn)，增加EPC2 會縮短化合物的保留時(shí)間。因此，本研究中對比了EPC2 的初始值為2 和10 mL/min 對化合物保留情況的影響，見圖1C，見圖1D，最終確定2 mL/min 為最佳初始值。IMS 檢測作為樣品的二次分離分析過程，主要影響因素為遷移管溫度（T1）。T1 的值越高，離子的活性越高，遷移時(shí)間越短，得到的化合物信息越少。因此，結(jié)合已有文獻(xiàn)[23]，T1 為45 ℃即可得到足夠的化合物信息。

圖1 優(yōu)化過程的氣相-離子遷移譜圖Fig.1 Spectra of the optimization process

2.2 VOCs 定性分析

將處理好的樣品60 ℃孵育10 min 后，直接進(jìn)行頂空進(jìn)樣分析，30 min 后得到樣品的揮發(fā)性組分圖譜，見圖2。譜圖縱坐標(biāo)為氣相保留時(shí)間（retention time of GC），橫坐標(biāo)為離子遷移時(shí)間（drift time），整個(gè)圖譜中橫坐標(biāo)1.0 位置為RIP（即反應(yīng)離子峰，drift time 約為8.04 ms）。RIP 兩側(cè)的每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物，顏色深淺代表化合物的濃度高低，顏色越淺表示濃度較低，顏色越深則表示濃度越高，整個(gè)譜圖上的點(diǎn)即代表了樣品中檢測到的所有VOCs。

本研究中的12 個(gè)樣本均為同一類型白酒樣本，含有的化合物種類相似度較高，圖2以樣品3-3 為例對其中的部分化合物進(jìn)行定性分析。本部分利用GCxIMS Library Search 軟件，通過內(nèi)置的NIST 2014 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與IMS 遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫對其中的53 個(gè)峰進(jìn)行了定性分析，化合物編號與圖2中的峰號一一對應(yīng)，其中部分物質(zhì)含有單體、二聚體兩個(gè)峰，具體VOCs 信息見表2。

表2 酒樣中檢測出的VOCsTable 2 VOCs detected in liquor samples

2.3 指紋圖譜對比分析

為了更直觀的對比不同年份酒樣中VOCs 成分的差異，本研究選取圖中的化合物峰作為待分析的點(diǎn)，通過LAV 軟件的Gallery Plot 插件生成VOCs指紋圖譜，見圖3。

由圖3可以看出：三組樣品的成分之間有較大差異，每組樣品組份內(nèi)部之間的差異較小。圖3中用括號標(biāo)注出了其中四處有明顯差異的區(qū)域（A、B、C、D）：其中，A 區(qū)域中的這些化合物在3 號組（兩年酒樣）中含量較高，而2 號組（五年酒樣）和1 號組（十年酒樣）中接近零點(diǎn)，說明這些化合物隨著貯藏年份的增加逐漸減少，其中包含α-蒎烯（α-Pinene），丁酸（Butanoic acid），異丙醇（Isopropyl alcohol）三個(gè)已鑒別成分；另外同年份酒樣中該部分化合物變化不明顯，說明老熟工藝對這部分化合物影響較小。B 區(qū)域中的這些化合物在3 個(gè)組份中均能檢測到，但2 號組（5年酒樣）中含量最高，說明這部分化合物隨著貯藏年份的增加含量先增加后減少，這些化合物可能穩(wěn)定性較差，其中包含2,3-丁二酮（2,3-butanedione），乙酸丙酯（Propyl acetate），苯甲醛（Benzaldehyde）和癸醛（decanal）四個(gè)已鑒別成分，C 區(qū)域中的這些化合物在1 號組（10年酒樣）中含量較高，而2 號組（5年酒樣）和3 號組（2年酒樣）中含量較低且3 號組較2 號組中的含量更低，說明這些化合物隨著貯藏年份的增加逐漸累積且年份越長含量越高，其中包含乙酸異丁酯（Isobutyl acetate），2,6-二甲基-4-庚酮（2,6-dimethyl-4-heptanone），3-辛酮（3-Octanone）和1-戊醇（1-Pentanol）等已知化合物；另外同年份酒樣中該部分化合物變化不明顯，說明老熟工藝對這部分化合物的影響較小。D 區(qū)域中的這些化合物在3 號組（兩年酒樣）中含量最高，1 號組（十年酒樣）中含量次之，2 號組（五年酒樣）中含量最低，說明這部分化合物隨著貯藏年份的增加含量先減少后增加，這些化合物可能是內(nèi)部物質(zhì)分解或者是合成的產(chǎn)物，其中以已知化合物辛醛（Octanal）為代表。另外，可以看出同一年份不同老熟狀態(tài)的白酒樣本中隨著老熟工藝的加深部分化合物含量會呈現(xiàn)或增高或降低的變化，說明老熟工藝會對白酒成分的變化造成一定影響，但從C 和D 兩個(gè)區(qū)域看來不同老熟處理的十年酒樣本中成分變化較小，說明老熟工藝對十年酒的影響較弱。多項(xiàng)研究表明，新釀酒中除水和乙醇外約含2.0%的風(fēng)味成分，其所含的風(fēng)味成分隨著貯藏時(shí)間的增加呈“酸增酯減”的大體趨勢，經(jīng)兩年貯藏后，大部分高含量成分如乙酸乙酯，乳酸乙酯，正丙醇，乙酸丙酯，正丁醇等含量已趨于穩(wěn)定[24?25]，因此，本研究中雖在樣本中鑒別出其中的一些成分但對于貯藏時(shí)間長于兩年后的酒樣的區(qū)分貢獻(xiàn)不大，故生成區(qū)分的指紋圖譜中并未選用此類成分的峰。由圖2結(jié)合已鑒別成分可以看出，隨著貯藏年份的增加，許多醛酮類成分含量也在逐漸增加，醛類和酮類物質(zhì)是香味的協(xié)調(diào)成分，有的醛類物質(zhì)有較強(qiáng)的刺激性，可增大酒勁并襯托香氣[26]。圖中對貯藏年份2年及以上白酒的年份區(qū)分具有較大貢獻(xiàn)的未知化合物有待于進(jìn)一步鑒別研究。

圖2 樣品的氣相-離子遷移譜圖（樣本3-3）Fig.2 Spectrogram of GC-IMS（sample 3-3）

圖3 不同年份白酒樣品的多成分差異性對比圖Fig.3 Comparison chart of multi-component differences of liquor samples

2.4 PCA 分析

PCA 分析可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維和規(guī)律性分析。通過對大量數(shù)據(jù)的矩陣分析，對特征向量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，從而減少數(shù)據(jù)維數(shù)，消除數(shù)據(jù)冗余，陸倫維等[27]已通過主成分分析方法對不等級的醬香型白酒實(shí)現(xiàn)了判別分析。為了更加直觀的對比各組分之間的差異，本研究利用LAV 軟件的PCA 分析插件對三組酒樣的12 個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析，相關(guān)矩陣的特征值等信息如表3所示。表3中顯示了6 個(gè)特征主成分信息，其中前2 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)90%以上，即前2 個(gè)主成分即可解釋90%以上的數(shù)據(jù)信息，故選取前2 個(gè)主成分進(jìn)行樣品的進(jìn)一步區(qū)分具有較強(qiáng)的可靠性。

表3 相關(guān)矩陣的特征值Table 3 Eigen-values of the correlation matrix

PC1 和PC2 兩個(gè)數(shù)據(jù)集的總得分高達(dá)94%，即可以解釋總變異的94%，以主成分PC1 為橫坐標(biāo)，PC2 為縱坐標(biāo)建立樣本的二維得分圖譜，結(jié)果見圖4。由圖4可知，每個(gè)樣品組組內(nèi)在圖譜中的分類較為明顯，組間分布較遠(yuǎn)，達(dá)到了較好的區(qū)分效果。

圖4 12 個(gè)樣品的PCA 分析圖譜Fig.4 PCA analysis pattern of 12 samples

2.5 PCA-CA 分析

主成分分析消除了指標(biāo)間相關(guān)性對結(jié)果的影響并對樣本進(jìn)行了簡單的區(qū)分，但并不能明確的顯示樣品間的聚類差異。因此，本研究中將PCA 分析與CA 分析相結(jié)合，這樣既避免指標(biāo)間相關(guān)性對結(jié)果的影響，避免指標(biāo)的取舍問題，降低計(jì)算量，同時(shí)又可以快速簡單地將分類結(jié)果用樹狀圖表示出來，增強(qiáng)結(jié)果的可讀性。由圖5可以看出，自然陳釀年份的影響占據(jù)了絕對優(yōu)勢，樣本明確的分為3 類：第一類（10年酒）中，隨著老熟工藝的應(yīng)用，樣品間的距離越來越遠(yuǎn)；第二類（5年酒）中，2-3 號樣本距離其余樣品最遠(yuǎn)，原因可能是對于第二類樣本來說，老熟處理工藝的影響較大；第三類（2年酒）中，3-0（原酒）與3-1 號樣本為一小組聚類，3-2 號樣本與3-3 號樣本為一小組聚類，說明這兩小組組內(nèi)樣本間差異較小，而且聚類規(guī)律并未隨著老熟工藝的進(jìn)行而產(chǎn)生規(guī)律性變動，可能是新酒穩(wěn)定性差的原因。另外，第一類與第二類樣本間的距離較近，第三類樣本與其余樣本相聚最遠(yuǎn)可能是由于第三類中的白酒樣本年份較新，樣品較不穩(wěn)定。隨著貯藏年份的增加，白酒中的物質(zhì)漸趨平衡穩(wěn)定，因此第二類與第三類樣本的距離較近。

圖5 12 個(gè)樣本的PCA-CA 分析圖譜Fig.5 PCA-CA analysis spectrum of 12 samples

3 結(jié)論

本研究首次將GC-IMS 技術(shù)和PCA-CA 數(shù)據(jù)處理方法相結(jié)合，并進(jìn)一步詳細(xì)研究其在醬香型釀造白酒年份快速鑒別中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)不同年份釀造白酒的快速區(qū)分。研究發(fā)現(xiàn)GC-IMS 技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確的對白酒中的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行鑒別，其中在本研究對象中共鑒別出53 種成分，結(jié)合儀器自帶軟件形成VOCs 指紋圖譜進(jìn)行初步的白酒樣本中化合物差異性對比。PCA-CA 數(shù)據(jù)處理方法消除了GCIMS 產(chǎn)生的大量的揮發(fā)性有機(jī)物指標(biāo)間相關(guān)性對結(jié)果的影響，避免指標(biāo)的取舍問題，降低數(shù)據(jù)維度和計(jì)算量，同時(shí)又可以快速簡單地將分類結(jié)果和遠(yuǎn)近關(guān)系用樹狀圖表示出來，增強(qiáng)結(jié)果的可讀性。本研究通過GC-IMS 技術(shù)和PCA-CA 數(shù)據(jù)處理相結(jié)合的方法快速實(shí)現(xiàn)了三組不同貯藏年份白酒的區(qū)分。然而，受樣本數(shù)量較少和樣本分散程度不均勻等問題的約束該方法仍有很大的提高空間，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步提升和優(yōu)化。