淡竹葉多糖的大孔吸附樹脂純化工藝及對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

鄧云兵，黃冬琴，岳天翔

（江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330038）

淡竹葉為禾本科淡竹葉屬的植物淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）的莖葉，富含多糖、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，具有清心除煩、生津止咳的功效[1?2]，常用于涼茶、飲料等食品的生產(chǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多糖化合物可增強(qiáng)體內(nèi)超氧化物歧化酶活性，延緩端粒縮短速度，同時(shí)提高谷胱甘肽過氧化物酶活力，使得體內(nèi)過氧化物的清除速度加快，減少有害產(chǎn)物丙二醛的累積，具有抗衰老、抗氧化和增強(qiáng)機(jī)體耐力等生物學(xué)活性[3?4]，如：Xie 等發(fā)現(xiàn)黨參多糖可明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間[5]；Zhang 等通過色譜柱純化得到的斜紋夜蛾多糖可明顯降低運(yùn)動(dòng)后血液乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶的水平[6]。

運(yùn)動(dòng)性疲勞通常源于機(jī)體運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，使得體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，造成組織損傷和肌肉收縮能力的下降[7?8]。由于目前淡竹葉多糖研究多集中于提取條件優(yōu)化和抗氧化活性探討[9?10]，暫未有文獻(xiàn)討論其對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的影響，同時(shí)提取產(chǎn)物中仍含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，可能影響其活性的發(fā)揮，為此本研究利用大孔樹脂吸附分離具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特性[11?12]，探討其純化淡竹葉多糖提取物的最佳工藝條件，同時(shí)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響，從而為相關(guān)運(yùn)動(dòng)食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

淡竹葉 購(gòu)自江西昌盛大藥房，經(jīng)鑒定為禾本科植物淡竹葉的葉片；西洋參口服液 金日制藥（中國(guó)）有限公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸 （Blood lactic acid,BLA）、乳酸脫氫酶 （Lactate dehydrogenase,LDH）、尿素氮 （Blood urea nitrogen,BUN）試劑盒 南京信帆生物有限公司；純化水 制于Millipore 超純水機(jī)；SPF 級(jí)健康雄性昆明小鼠 100 只，體質(zhì)量15～22 g，由江西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （許可證號(hào)：SYXK 2018-0006）。

DX-30B 型粉碎機(jī) 廣州祥明機(jī)械設(shè)備有限公司；721 型紫外-可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；FA2104J 型電子天平 上海恒平科技有限公司；SM-150D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 南京舜瑪科技有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LC-10N-50A 型冷凍干燥箱 上海力辰儀器制造有限公司；TG-15 型高速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；SHA-C 型恒溫振蕩器 國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；AB-8、H-103、D-101 型大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；HPD 300、HPD 400 型大孔樹脂 北京索萊寶科技有限公司；DM 301、NKA-9 型大孔樹脂 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；動(dòng)物恒溫游泳池 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取物制備 淡竹葉經(jīng)烘干后粉碎，過80 目篩，以水作提取溶劑，在固液比1:35 的條件下于200 W、50 ℃下，超聲提取30 min 后過濾，濾渣再次提取，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，經(jīng)無水乙醇沉淀后抽濾，冷凍干燥即得[13]。

1.2.2 多糖含量測(cè)定 稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，先后加入5%苯酚溶液和濃硫酸處理后，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值[14]，隨后以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.013x?0.0206（r=0.9954），表明葡萄糖濃度在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，另于相同波長(zhǎng)測(cè)定樣品的吸光度，平行測(cè)定六次，通過下式計(jì)算樣品的多糖純度。

式中：c 為多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為樣品溶液體積，mL；m0為樣品質(zhì)量，mg；D 為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 大孔樹脂型號(hào)篩選 經(jīng)預(yù)處理后的2.0 g 不同型號(hào)樹脂置于150 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL 多糖提取液，于25 ℃振蕩吸附12 h 后過濾，測(cè)得上清液的多糖質(zhì)量濃度，通過下式計(jì)算樹脂的吸附率[15]。

式中：c0為提取液中多糖濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度，mg/mL；Qe為吸附率，%。

吸附后的大孔樹脂經(jīng)過濾后，加入100 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，于相同條件靜態(tài)洗脫12 h后，測(cè)得上清液的多糖濃度，通過下式計(jì)算洗脫率與回收率[16]。

式中：c0為提取液中多糖濃度，mg/mL；ce為飽和吸附后上清液中多糖濃度，mg/mL；cd為洗脫液中多糖濃度，mg/mL；V0為提取液體積，mL；Vd為洗脫液體積，mL；Dd為洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.2.4 樹脂靜態(tài)吸附-解吸動(dòng)力學(xué)曲線 將預(yù)處理后的2.0 g AB-8 型大孔樹脂置于150 mL 具塞錐形瓶?jī)?nèi)，加入30 mL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL 多糖提取液后振蕩吸附，于不同時(shí)間測(cè)定上清液的多糖濃度后，繪制靜態(tài)吸附曲線，隨后過濾，另加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，振蕩洗脫，測(cè)得不同時(shí)間上清液的多糖質(zhì)量濃度，繪制樹脂的靜態(tài)洗脫曲線，另利用用不同動(dòng)力學(xué)模型研究AB-8 型樹脂對(duì)淡竹葉多糖的吸附機(jī)制。

式中：K1為準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)，min?1；K2為準(zhǔn)二級(jí)速率常數(shù)，mL?mg?1·min?1；τt為多糖吸附量，mg/g；τe為多糖飽和吸附量，mg/g。

1.2.5 樹脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫條件考察

1.2.5.1 不同吸附條件考察 分別考察上樣質(zhì)量濃度、樣液pH、上樣體積及上樣流速對(duì)樹脂的吸附率影響，具體如下：當(dāng)樣液pH 為5.0，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為60 mL 時(shí)，上樣質(zhì)量濃度分別為：1、3、5、7、9 mg/mL；當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL，上樣流速為2 mL/min，上樣液體積為60 mL 時(shí)，樣液pH 分別為：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL，樣液pH 為5.0 時(shí)，繪制上樣流速分別為1、2、3 mL/min 的泄漏曲線。

1.2.5.2 不同洗脫條件考察 以乙醇溶液作洗脫液，分別考察洗脫液體積分?jǐn)?shù)、體積和洗脫流速對(duì)目標(biāo)化合物解吸的效果影響，具體如下：當(dāng)洗脫流速為1 mL/min，洗脫液體積160 mL 時(shí)，洗脫液體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%；當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，繪制洗脫流速分別為1、2、3 mL/min時(shí)洗脫曲線。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1 分組與劑量設(shè)計(jì) 100 只健康雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后（飼養(yǎng)環(huán)境溫度：20～25 ℃，相對(duì)濕度：50%～70%），按體質(zhì)量隨機(jī)分為5 組，即空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和低、中、高劑量組，每組各20 只，根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)》要求，設(shè)計(jì)人體推薦攝入劑量的10、20、30 倍，作為低、中、高劑量組動(dòng)物每日淡竹葉多糖純化物的攝入量，即0.10、0.20、0.30 mg/g/d，空白對(duì)照組則給予生理鹽水，陽性對(duì)照組則給予西洋參口服液（2 mg/mL），各組動(dòng)物均按照0.2 mL/g 體重灌胃，全部動(dòng)物每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30 d，灌胃期間可自由喂食與飲水[17?18]。

1.2.6.2 力竭游泳時(shí)間 末次灌胃后，各組動(dòng)物于鼠尾負(fù)重5%體質(zhì)量重物，置于（25±2）℃游泳池內(nèi)開展負(fù)重游泳試驗(yàn)，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10 s 的時(shí)間[19]。

1.2.6.3 生化指標(biāo)測(cè)定 末次灌胃結(jié)束后，各組剩余動(dòng)物游泳30 min，取出擦凈，休息10 min 后，于眼底取血，離心，制備血清，照相關(guān)試劑盒說明書要求，檢測(cè)各組小鼠血清中BLA 與BUN 的含量及LDH活力[20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，利用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05 判斷為差異顯著，P<0.01 判斷為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂型號(hào)確定

不同型號(hào)的樹脂的比表面積和極性不同，因此對(duì)目標(biāo)化合物的吸附與解吸效果存在較大差異，分別考察不同類型大孔樹脂的吸附與解吸效果，結(jié)果見表1。從表1可見，H 103 型大孔樹脂對(duì)多糖化合物的解吸率僅為51.6%，這歸因于該樹脂的比表面積較大，吸附位點(diǎn)較多，而多糖化合物具有弱極性，因此較難解吸，HPD-300 型大孔樹脂的吸附率雖達(dá)到88.2%，但解吸率僅為68.6%，而AB-8 型大孔樹脂比表面積適中，且回收率達(dá)到74.5%，因此確定采用AB-8 型大孔樹脂純化淡竹葉多糖提取物。

表1 不同類型大孔樹脂的吸附與解吸效果Table 1 Adsorption and desorption performance of different types of macroporous resins

2.2 樹脂靜態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)曲線

圖1為AB-8 型大孔樹脂的靜態(tài)吸附曲線，從圖1可知，該吸附過程為中速平衡型，在前4 h 樹脂的吸附率增長(zhǎng)較快，隨后逐漸緩慢，至8 h 后基本不再變化達(dá)到平衡，因此該樹脂對(duì)淡竹葉多糖的靜態(tài)吸附時(shí)間為8 h。圖2為AB-8 型大孔樹脂的靜態(tài)洗脫曲線，從圖2可知，該解吸過程為快速平衡型，前3 h洗脫率迅速增大，隨后趨于穩(wěn)定，達(dá)到平衡。采用一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分別擬合上述吸附過程，結(jié)果見表2。從表2可知，采用二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合方程的相關(guān)系數(shù)較大，因此該吸附過程更接近于二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型特征，吸附過程可能受到外部擴(kuò)散、邊界層擴(kuò)散或顆粒內(nèi)擴(kuò)散控制。

表2 吸附動(dòng)力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 2 The fitting parameters of adsorption kinetics models

圖1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption kinetics curve

圖2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The static desorption kinetics curve

2.3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響

不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附率的影響，見圖3所示。從圖3可見，隨著上樣質(zhì)量濃度的增大，樹脂的吸附率先升高后降低，這歸因于當(dāng)上樣質(zhì)量濃度較低時(shí)，樹脂的吸附位點(diǎn)較多，而隨著濃度不斷增大，樣品中雜質(zhì)的含量亦逐漸增加，不僅易堵塞樹脂，同時(shí)可與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)吸附活性位點(diǎn)[21]，因此確定最佳上樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響Fig.3 Effect of sample concentration on the adsorption rate

2.4 樣液pH 對(duì)吸附效果的影響

不同樣液的pH 對(duì)樹脂吸附率的影響，見圖4。從圖4可知，隨著樣液pH 的升高，樹脂對(duì)多糖的吸附率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)樣液pH 為5.0 時(shí)，吸附率達(dá)到最大，這可能源于多糖類化合物在酸、堿條件下均易發(fā)生水解反應(yīng)，從而影響目標(biāo)化合物的溶解度與化學(xué)性質(zhì)[22]，而溶液處于弱酸性時(shí)，多糖更易于被樹脂吸附，這與陳艷等利用大孔樹脂純化松茸多糖研究結(jié)論一致[23]，因此確定樣液最佳pH 為5.0。

圖4 樣液pH 對(duì)吸附率的影響Fig.4 Effect of pH value of sample solution on the adsorption rate

2.5 上樣流速對(duì)吸附效果的影響

隨著上樣液體積的不斷增大，樹脂的吸附位點(diǎn)逐漸飽和，從而吸附能力不斷下降，使得流出液中多糖濃度持續(xù)升高，若流出液中多糖濃度約為上樣質(zhì)量濃度的10%，則認(rèn)為樹脂已吸附飽和并出現(xiàn)泄漏[24]，若上樣液體積過大且流速過快，不僅使得目標(biāo)化合物無法與樹脂充分接觸，也容易出現(xiàn)樹脂過載，因此分別考察不同上樣流速的樹脂泄露曲線，結(jié)果見圖5。從圖5可知，隨著上樣液體積的增多，流出液中多糖濃度不斷增大，樹脂最終達(dá)到飽和吸附，另外隨著流速加快，樹脂開始泄漏時(shí)的上樣液體積不斷減少，結(jié)合實(shí)際吸附效率，確定最佳上樣流速為2.0 mL/min，上樣液體積為60 mL。

圖5 不同上樣流速的泄漏曲線Fig.5 The leakage curve in different loading speed

2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響

圖6為不同洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響，當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)增大至80%后，洗脫率開始下降，這歸因于洗脫液的體積分?jǐn)?shù)過低或過高，其極性均與目標(biāo)化合物相差較大，不能破壞樹脂與多糖形成的氫鍵[25]，同時(shí)其它吸附雜質(zhì)也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)脫附，致使洗脫率降低，因此確定洗脫液的體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖6 洗脫液體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響Fig.6 The effect of volume fraction of eluent on the desorption rate

2.7 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

洗脫流速過快會(huì)使洗脫液與樹脂接觸不充分，為此考察飽和吸附后的樹脂在不同洗脫流速下的解吸曲線，結(jié)果見圖7。從圖7可知，洗脫流速過大，曲線峰型逐漸變寬、拖尾嚴(yán)重，且用量增多，當(dāng)采用80%乙醇以1.0 mL/min 流速洗脫飽和吸附樹脂后，洗脫曲線單一、對(duì)稱、尖銳，且無明顯拖尾，因此確定最佳洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫液用量160 mL。

圖7 不同洗脫流速的解吸曲線Fig.7 The dynamic desorption curve in different flow rate of elution

2.8 最佳工藝驗(yàn)證

按照上述試驗(yàn)確定的最佳純化工藝，即配制體積為60 mL，pH5，質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，以2.0 mL/min 流速，上樣至AB-8 型大孔樹脂飽和吸附后，采用體積為160 mL 80%乙醇溶液，以1.0 mL/min 流速洗脫，產(chǎn)物的多糖純度由16.39%±1.06%提高至 57.37%±1.72%，約為純化前3.5 倍。

2.9 淡竹葉多糖對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

2.9.1 淡竹葉多糖對(duì)力竭游泳時(shí)間影響 負(fù)重游泳試驗(yàn)是考察動(dòng)物運(yùn)動(dòng)耐力的常用模型，通過力竭游泳時(shí)間的測(cè)定，可客觀反映淡竹葉多糖對(duì)機(jī)體疲勞緩解的效果，各組小鼠的力竭游泳時(shí)間結(jié)果見表3。從表3可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組和陽性對(duì)照組均顯著延長(zhǎng)動(dòng)物的力竭游泳時(shí)間，其中，中劑量組差異顯著（P<0.05），而高劑量組和陽性對(duì)照組差異極顯著（P<0.01），表明中、高劑量淡竹葉多糖有助于提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力，延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)時(shí)間，另外高劑量組與陽性對(duì)照組具有極顯著性差異（P<0.01）。

表3 淡竹葉多糖對(duì)小鼠力竭游泳時(shí)間的影響Table 3 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on exhaustive swimming time of mice

2.9.2 淡竹葉多糖對(duì)BLA 和LDH 的影響 高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)供氧不足，部分血糖轉(zhuǎn)化成乳酸，造成四肢肌肉酸痛，而乳酸脫氫酶有利于催化乳酸脫氫形成丙酮酸，減少體內(nèi)乳酸累積[26]，淡竹葉多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血清BLA 和LDH 的影響，見表4。從表4可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組與陽性對(duì)照組小鼠的BLA 濃度均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05,P<0.01），而LDH 活力則有顯著提高 （P<0.05,P<0.01），表明中、高劑量淡竹葉多糖有利于明顯增強(qiáng)乳酸脫氫酶活力，減小體內(nèi)乳酸含量，高劑量組BLA 濃度和LDH 活力較陽性對(duì)照組具有顯著性差異 （P<0.05）。

表4 淡竹葉多糖對(duì)BLA 和LDH 的影響Table 4 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BLA and LDH

2.9.3 淡竹葉多糖對(duì)體內(nèi)尿素氮含量影響 當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)，血糖供應(yīng)不足，超出體力負(fù)荷承載能力時(shí)，體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸分解代謝加快，以補(bǔ)充額外能量，使得代謝產(chǎn)物尿素氮含量迅速增大[27]，淡竹葉多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠血清尿素氮含量的影響見表5。從表5可知，與空白對(duì)照組相比，中、高劑量組與陽性對(duì)照組小鼠的BUN 濃度均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05,P<0.01），表明中、高劑量組可減少運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解利用，但高劑量組的BUN 濃度與陽性對(duì)照組相較，差異具有顯著性 （P<0.05）。

表5 淡竹葉多糖對(duì)BUN 的影響Table 5 The effect of polysaccharides of Lophatherum gracile Brongn.on BUN

3 結(jié)論

隨著對(duì)可食用性植物有效成分的生物活性研究不斷深入，諸如：多糖、黃酮、皂苷類物質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)對(duì)活性氧自由基具有較強(qiáng)清除能力，而機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)易導(dǎo)致活性氧自由基積累，引發(fā)軀體性疲勞，為此本研究探討了大孔樹脂純化淡竹葉多糖的最佳工藝條件并分析其對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力影響。當(dāng)配制體積為60 mL，pH5，質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，以2 mL/min 流速，上樣至AB-8 型大孔樹脂飽和吸附后，采用體積為160 mL 80%乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脫，產(chǎn)物的多糖純度由16.39%提高至57.37%，約為純化前3.5 倍。孫偉曾采用D101大孔樹脂純化桑白皮多糖，產(chǎn)物純度約為純化前4.6 倍[28]，而張洪坤曾采用AB-8 大孔樹脂純化茯苓多糖，產(chǎn)物純度為約為純化前3.2 倍[29]，表明該工藝分離純化效果較好，適于淡竹葉多糖提取物的純化。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，淡竹葉多糖的劑量與增強(qiáng)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力呈正相關(guān)，隨著多糖劑量的增大，有助于延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間，提高體內(nèi)乳酸脫氫酶活性，從而加快體內(nèi)乳酸代謝，減小對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響，同時(shí)避免了蛋白質(zhì)與氨基酸的分解代謝，這與焦迎春等研究柴達(dá)木大肥菇多糖的抗疲勞活性結(jié)果基本一致[30]。本研究可為淡竹葉多糖增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力的功能性食品開發(fā)提供參考，促進(jìn)該資源的開發(fā)利用，但其具體的抗疲勞機(jī)制和人體安全劑量尚需進(jìn)一步研究。