三華李果坯發(fā)酵液中腐敗真菌分離鑒定、相關(guān)抑菌劑效價評定及發(fā)酵工藝優(yōu)化

黃志鈺，沈雪玉，陳珣琳，郭卓釗，黃 葦,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東正一品生物科技股份有限公司，廣東廣州 515638）

三華李作為華南地區(qū)特色優(yōu)質(zhì)水果[1]，具有維生素、有機酸和氨基酸等多種營養(yǎng)成分[2]，是廣式蜜餞涼果的主要原料之一。然而，鮮果采后由于自身帶有大量的細(xì)菌、霉菌和酵母菌而不耐貯藏。導(dǎo)致水果采后腐敗的常見微生物有青霉屬（Penicilliumspp.）、炭疽菌屬（Colletotrichumspp.）、鏈格孢屬（Alternariaspp.）、褐腐菌屬（Moniliniaspp.）、毛霉屬（Mucorspp.）以及根霉屬（Rhizopusspp.）等[3]。此外不同地區(qū)的水果優(yōu)勢腐敗菌也不同。黃月[4]從新鮮三華李果表面分離出4 株優(yōu)勢腐敗菌，分別為漢遜德巴利氏酵母、巴斯德畢赤酵母、膠紅酵母以及枝孢霉菌。

傳統(tǒng)廣式蜜餞涼果加工常采用高鹽硫藏工藝，以低成本保藏的三華李果坯作為原料，保證生產(chǎn)周年進(jìn)行，但容易出現(xiàn)果坯硫殘超標(biāo)、廢液污染環(huán)境等問題[5?7]。為了改善現(xiàn)狀，有研究者以乳酸菌作為發(fā)酵菌種，進(jìn)行了三華李果坯發(fā)酵保藏工藝的研究[8?9]。然而該工藝尚不完善，發(fā)酵液表面容易出現(xiàn)白色菌膜，導(dǎo)致果坯軟爛、產(chǎn)生異味等發(fā)酵異常的情況。

添加抑菌劑是防止食品腐敗變質(zhì)的常用方法。山梨酸及其鉀鹽是公認(rèn)的安全高效食品抑菌劑，能較好地抑制霉菌、酵母菌及好氧型細(xì)菌的生長繁殖[10]。二甲基二碳酸鹽能在常溫和低溫環(huán)境中發(fā)揮較強的殺菌作用，對酵母菌殺滅作用強于細(xì)菌和霉菌，安全性高[11?13]。納他霉素作為食品中最常用的天然抑菌劑，具有廣譜抗真菌性，已獲得廣泛應(yīng)用[14?15]。由于不同抑菌劑的抑菌效力不同，且單一抑菌劑具有局限性，故在實際生產(chǎn)中，常采用多種抑菌劑復(fù)配使用，通過協(xié)同作用來提高抑菌效力[16]。

本文在前人研究基礎(chǔ)上，分析導(dǎo)致三華李果坯乳酸菌發(fā)酵異常的原因，從發(fā)酵液中分離并鑒定導(dǎo)致發(fā)酵異常的優(yōu)勢腐敗菌，并有針對性的選擇山梨酸、納他霉素和二甲基二碳酸鹽為抑菌劑，評價它們對優(yōu)勢腐敗菌及接種用乳酸菌的抑菌活性，利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，解決三華李果坯發(fā)酵效果不穩(wěn)定的問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮三華李 購于廣州市天平架水果批發(fā)市場；MRS 培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix 廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司；樹脂天青，純度90% 上海麥克林生化科技有限公司；山梨酸、納他霉素、二甲基二碳酸鹽 食品級，廣州新如榮生物科技有限公司；無水葡萄糖 分析純，山東祥瑞藥業(yè)有限公司；氯化鈉 分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

Thermal Cycler2720 PCR 儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SYQ-DSX-280B 手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-6C 電泳儀北京六一生物科技有限公司；Gel DocTM XR+紫外分析儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；SWCJ-1F 單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZTHZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床、LRH 生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MJ30 透反射顯微鏡廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 三華李果坯發(fā)酵工藝 選取7～8 成熟的新鮮三華李果，洗凈表面雜質(zhì)，瀝水待用。在發(fā)酵罐中以果:水（質(zhì)量比）=1:1.8 混合，按水重加入1.8%的無水葡萄糖，1.7%的氯化鈉，2%的復(fù)合菌液（植物乳桿菌:干酪乳桿菌:腸膜明串珠菌=3:1:8）[17]，室溫（25～37 ℃）密封發(fā)酵30 d。由于不同批次的三華李果攜帶初始微生物數(shù)量不定，在該工藝下，容易出現(xiàn)發(fā)酵異常的情況。

1.2.2 三華李發(fā)酵液中優(yōu)勢腐敗真菌的分離純化從發(fā)酵異常的三華李發(fā)酵液中均勻取樣，按10 倍系列稀釋至10-4，分別取100 μL 發(fā)酵原液及各稀釋梯度發(fā)酵液在PDA 固體培養(yǎng)基上涂布，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，進(jìn)行菌落形態(tài)的觀察，用接種環(huán)挑取優(yōu)勢單菌落在新的PDA 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離純化，至少純化三代，得到純種菌株。

1.2.3 顯微鏡觀察 在載玻片上滴一滴無菌水，挑取少量純化單菌落均勻涂抹于載玻片，經(jīng)酒精燈火焰固定后，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.2.4 優(yōu)勢腐敗真菌的分子鑒定 真菌分子鑒定方法由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司提供并稍加修改，具體步驟如下：

1.2.4.1 DNA 的提取 將分離純化待鑒定的菌株接種于液體PDB 培養(yǎng)基中。28 ℃活化2 d，離心取0.5 g 菌體，選擇十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取待鑒定菌株的基因組DNA。

1.2.4.2 PCR 擴增反應(yīng)體系及程序 對所得基因組DNA 的ITS 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)總體積為30 μL，其中引物濃度為10 mmol/L，ITS1：TCCGTA GGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTG ATATGC，各1 μL，2×PCR Mix 15 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水12 μL。PCR 反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4.3 PCR 產(chǎn)物檢測 PCR 反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4.4 PCR 產(chǎn)物測序與結(jié)果分析 PCR 擴增后的產(chǎn)物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測序。將測序后的結(jié)果放入NCBI 基因庫中進(jìn)行同源序列比對，并用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5 三種抑菌劑對優(yōu)勢腐敗真菌抑菌效價的評定

1.2.5.1 菌懸液的制備 在盧小菊等[18]的方法上加以修改，將1.2.4 中鑒定得到的優(yōu)勢腐敗真菌分別接種于PDB 液體培養(yǎng)基中，搖床28 ℃，150 r/min，活化培養(yǎng)2 d，使菌液濃度為108CFU/mL 左右備用。

1.2.5.2 抑菌劑處理 將抑菌劑山梨酸、納他霉素和二甲基二碳酸鹽配制成溶液，在超凈臺用無菌0.22 μm 濾膜過濾后備用。

1.2.5.3 牛津杯法測定抑菌效力 在趙國群等[19]方法上加以改進(jìn)，抑菌劑溶液濃度配制為10 mg/mL。在溫度約為45 ℃的半固體PDA 培養(yǎng)基中接入1.2.5.1活化好的菌液，使得PDA 培養(yǎng)基中菌液濃度稀釋為106CFU/mL 左右，緩慢混勻后倒在固體PDA 培養(yǎng)基表面。待含菌培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取200 μL抑菌劑加入牛津杯中，用相應(yīng)抑菌劑溶劑做陰性對照，28 ℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵所用乳酸菌，37 ℃生長48 h，其他操作相同。每種抑菌劑試驗重復(fù)3 次。

1.2.5.4 最小抑菌、殺菌濃度的測定 在CLSI[20]即美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute）制定的藥敏M07-A9 版標(biāo)準(zhǔn)上稍加修改，采用微量二倍稀釋法測定MIC 和MBC 值。

取適量顯色劑刃天青用三級水配制成0.1%母液，過0.22 μm 無菌濾膜待用。在無菌PDB 培養(yǎng)基中加入經(jīng)過濾的顯色劑溶液，使其在PDB 培養(yǎng)基中終濃度為0.01%[21]。取96 孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板，用多通道移液槍在每孔中加入100 μL 含有顯色劑的PDB培養(yǎng)基。在96 孔板頂行的第一個孔中加入100 μL抑菌劑溶液，與培養(yǎng)基混勻后從頂部孔吸取100 μL轉(zhuǎn)移到頂行的下一個孔，制備2 倍連續(xù)稀釋液，除無菌空白對照孔外，所有孔均加入100 μL 的待測菌液，每個濃度設(shè)置3 個平行。每個孔中約有5×105CFU/mL的供試菌。其中兩行微孔分別加入等量抑菌劑溶劑作為陽性對照，無菌PDB 培養(yǎng)基為陰性對照。

96 孔板經(jīng)28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察每孔顏色變化。無微生物生長的孔呈藍(lán)色，有少量微生物生長的孔呈淡粉色，大量微生物生長的孔呈淡黃色或白色。96 孔板中試驗孔呈藍(lán)色，表明腐敗真菌生長受到抑制，試驗孔對應(yīng)的最小抑菌劑濃度為該抑菌劑對供試菌的MIC 值。從呈藍(lán)色有抑菌作用的試驗孔中分別取100 μL 混合液涂布于無菌PDA 平板，28 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察菌落生長情況。以平板上無菌落生長的最低抑菌劑濃度為該抑菌劑對供試菌的MBC值。本試驗重復(fù)3 次。

1.2.5.5 聯(lián)合抑菌活性測定 根據(jù)MIC 測定結(jié)果，采用棋盤稀釋法（checkerboard method）測定三種抑菌劑兩兩聯(lián)合使用對優(yōu)勢腐敗真菌的抑制情況，如圖1所示。

圖1 棋盤稀釋法加抑菌劑示意圖Fig.1 Schematic diagram of bacteriostatic agent added by checkerboard dilution method

取無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用移液槍在第1～8 列沿Y 軸方向從上到下每列孔依次加入：2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、0 的A 抑菌劑溶液50 μL，在第1～8 行沿X 軸方向從左至右每行孔中依次加入2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC、1/32 MIC、0 的B 抑菌劑溶液50 μL，將兩種抑菌劑溶液混勻后，在上述孔中加入100 μL 含有顯色劑刃天青的供試菌液，使得每孔菌液濃度約為5×105CFU/mL，加蓋混勻，置于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察每孔顏色變化。山梨酸、納他霉素和二甲基二碳酸鹽溶液按上述方法兩兩配對，對每種菌重復(fù)3 次試驗。

FICI 指數(shù)計算公式為，F(xiàn)ICI 指數(shù)=（A 聯(lián)用時的MIC/A 單獨時的MIC）+（B 聯(lián)用時的MIC/B 單獨時的MIC）。用部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）對棋盤稀釋法結(jié)果進(jìn)行評價[22]。判定標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)FICI≤0.5，是協(xié)同作用；0.52，是拮抗作用。

1.2.6 響應(yīng)面試驗 參照黃月[4]和李媛[17]山梨酸和納他霉素用量，結(jié)合本文聯(lián)合抑菌試驗結(jié)果，在國標(biāo)GB 2760-2014 最大允許添加量條件下，以山梨酸（A）、納他霉素（B）和二甲基二碳酸鹽（C）添加量為自變量，發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計3 因素3 水平的Box-Behnken 實驗，實驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平設(shè)計表Table 1 Box-Behnken test factors level design table

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗進(jìn)行3 次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)由SPSS 16.0 軟件處理，利用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三華李發(fā)酵液中優(yōu)勢腐敗真菌的分離純化

本文從接種乳酸菌發(fā)酵異常的發(fā)酵液中均勻取樣，經(jīng)PDA 平板涂布、劃線分離培養(yǎng)和菌落形態(tài)觀察，共得到3 株代表性顯著的優(yōu)勢菌株，分別編號為C2、6H7、6H8，菌落形態(tài)如圖2所示。從圖2a 中可知，C2 菌株在PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)表現(xiàn)為菌落呈球形突起，白色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤。6H7 菌株菌落形態(tài)（圖2b）在PDA 培養(yǎng)基上表現(xiàn)為圓形，乳白色，邊緣整齊有菌絲，表面光滑、濕潤。6H8 菌株（圖2c）在PDA 培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)近圓形，乳白色，邊緣不整齊，表面光滑、濕潤，符合真菌菌落形態(tài)特征。

圖2 發(fā)酵液中優(yōu)勢腐敗真菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of dominant spoilage fungi in fermentation broth

2.2 顯微鏡觀察結(jié)果

將分離純化得到的3 株優(yōu)勢腐敗真菌培養(yǎng)在PDA 固體培養(yǎng)基上，用接種環(huán)挑取少量單菌落均勻涂于載玻片，用顯微鏡觀察菌體形態(tài)。如圖3a 所示，C2 菌株細(xì)胞形態(tài)主要為橢圓形，多為出芽繁殖。6H7 菌株（圖3b）細(xì)胞形態(tài)為橢圓形，也呈出芽繁殖。6H8 菌株（圖3c）細(xì)胞形態(tài)多為橢圓形，出芽繁殖，有些細(xì)胞粘連呈串珠狀結(jié)構(gòu)。符合酵母菌的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 優(yōu)勢酵母菌鏡檢下的細(xì)胞形態(tài)（×800）Fig.3 Cell morphology of dominant yeasts under microscope（×800）

綜上所述，可以推斷出從發(fā)酵液中分離純化得到的3 株優(yōu)勢腐敗真菌為酵母菌。

2.3 優(yōu)勢腐敗真菌的分子鑒定

2.3.1 PCR 產(chǎn)物檢測 以引物ITS1/ITS4 對3 株優(yōu)勢腐敗真菌的基因序列進(jìn)行PCR 擴增，采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。從圖4可以看出，每個菌株均出現(xiàn)一條大小在500～750 bp 左右的特異性擴增條帶，且條帶較為明亮，表明引物選擇正確，目的基因得到擴增，PCR 擴增產(chǎn)物符合測序標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 優(yōu)勢腐敗真菌PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products of dominant spoilage fungi

2.3.2 PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果分析 將3 株腐敗真菌的PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果在GeneBank 的BLAST 上進(jìn)行比對分析，通過供試菌株在NCBI 上同源性的比對結(jié)果，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖5可知，C2 菌株與Candida stellimalicolaFM180552.1在同一支，且序列相似度為95%，結(jié)合菌落形態(tài)特征，C2 菌株被鑒定為Candida stellimalicola。由圖6可知，6H7 菌株與Pichia kudriavzevii的相關(guān)序列在同一分支，序列相似度高達(dá)100%，對比菌落形態(tài)，6H7 菌株被鑒定為Pichia kudriavzevii。由圖7可知，菌株6H8 與Pichia occidentalisKY849376.1 在同一支，序列相似度為100%，參考菌落形態(tài)特征，6H8 菌株被鑒定為Pichia occidentalis。

圖5 基于C2 菌株ITS 序列及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the ITS sequence of C2 strain and its similar strains

圖6 基于6H7 菌株ITS 序列及相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on the ITS sequence of 6H7 strain and similar strain

圖7 基于6H8 菌株ITS 序列及相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on ITS sequence of 6H8 strain and similar strains

綜上所述，通過分離鑒定可知，導(dǎo)致腐敗的優(yōu)勢真菌為3 株酵母菌，其中C2 菌株為假絲酵母亞種（Candida stellimalicola），6H7 菌株為庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），6H8 菌株為西方畢赤酵母（Pichia occidentalis）。

2.4 三種抑菌劑抑菌效價的評定

為優(yōu)選對腐敗菌具有強抑制作用，但對接種乳酸菌不會產(chǎn)生不良影響的抑菌劑，進(jìn)行以下試驗。

2.4.1 牛津杯法測定抑菌效力 表2為3 種抑菌劑對6 株供試菌的牛津杯抑菌結(jié)果。當(dāng)抑菌劑濃度在10 mg/mL 時，二甲基二碳酸鹽對發(fā)酵用的干酪乳桿菌有一定的抑制效果，抑菌圈直徑為（10.45±0.11）mm，山梨酸和納他霉素對干酪乳桿菌沒有抑制作用。3 種抑菌劑對發(fā)酵用植物乳桿菌和腸膜明串珠菌無抑制作用，對致腐酵母菌抑制作用明顯，其中二甲基二碳酸鹽對C2 和6H7 菌株抑制效果較好，抑菌圈直徑分別為（25.35±0.36）mm 和（24.21±0.74）mm。納他霉素對6H8 菌株抑制效果好，抑菌圈直徑為（26.71±1.00）mm。山梨酸對C2 菌株抑制效果好，抑菌圈直徑為（20.80±0.71）mm。

表2 不同抑菌劑對供試菌的抑菌效力Table 2 Antibacterial efficacy of different antibacterial agents on the tested bacteria

綜合來看，3 種抑菌劑對3 株致腐酵母菌的抑制效果良好，二甲基二碳酸鹽雖然對干酪乳桿菌略有抑制作用，但不會影響整體發(fā)酵的正常進(jìn)行。3 種抑菌劑均可應(yīng)用于抑制發(fā)酵液中致腐酵母菌的生長繁殖。

2.4.2 最小抑菌、殺菌濃度的測定 采用微量二倍稀釋法測定3 種抑菌劑對3 株腐敗酵母菌MIC 及MBC 值，結(jié)果如表3～表5所示。山梨酸（表3）對3 株供試菌的抑制效果由強到弱依次為：C2≥6H7=6H8。從表4中可以得知，僅需3.91～7.81 μg/mL 的納他霉素溶液就能抑制腐敗酵母菌的生長，當(dāng)溶液濃度達(dá)到31.25 μg/mL 時可以完全殺死供試菌，說明對3 株腐敗酵母菌的抑制和殺死能力極強。而二甲基二碳酸鹽（表5）對供試菌抑制效果較弱，其濃度需在125～250 μg/mL 時才有抑制作用，只有達(dá)到20～40 mg/mL 時，二甲基二碳酸鹽才能完全殺死致腐酵母菌。這可能與初始菌液濃度和二甲基二碳酸鹽易分解的性質(zhì)有關(guān)。

表3 山梨酸對腐敗酵母菌的MIC 和MBC 值Table 3 MIC and MBC values of sorbic acid on spoilage yeast

表4 納他霉素對腐敗酵母菌的MIC 和MBC 值Table 4 MIC and MBC values of natamycin on spoilage yeast

表5 二甲基二碳酸鹽對腐敗酵母菌的MIC 和MBC 值Table 5 MIC and MBC values of dimethyl dicarbonate on spoilage yeast

2.4.3 聯(lián)合抑菌活性測定 以FICI 指數(shù)來判定抑菌活性[22]，指數(shù)越小協(xié)同作用越強。由表6可知，山梨酸和納他霉素復(fù)配后C2 和6H8 菌株的FICI 指數(shù)均為0.53，表現(xiàn)出部分協(xié)同或相加作用，6H7 菌株FICI 指數(shù)為0.50，表現(xiàn)出協(xié)同作用。通過表7可知，山梨酸與二甲基二碳酸鹽復(fù)配后的C2 和6H8 菌株的FICI 等于或小于0.50，表現(xiàn)出協(xié)同作用，6H7 菌株FICI 為0.53，表現(xiàn)出部分協(xié)同或相加的作用。而從表8中可以看出，納他霉素與二甲基二碳酸鹽復(fù)配后對3 株供試菌的FICI 指數(shù)均較大，C2 和6H7菌株的FICI 接近1，協(xié)同抑菌作用較弱，說明兩者的聯(lián)合抑菌效果一般。

表6 山梨酸與納他霉素對三株供試酵母菌聯(lián)合抑菌的結(jié)果Table 6 The combined antibacterial results of sorbic acid and natamycin on the three tested yeasts

表7 山梨酸與二甲基二碳酸鹽對三株供試酵母菌聯(lián)合抑菌的結(jié)果Table 7 The combined antibacterial results of sorbic acid and dimethyl dicarbonate on the three tested yeasts

表8 納他霉素與二甲基二碳酸鹽對三株供試酵母菌聯(lián)合抑菌的結(jié)果Table 8 The combined antibacterial results of natamycin and dimethyl dicarbonate on the three tested yeasts

綜合以上結(jié)果可知，三種抑菌劑復(fù)配使用能在較低濃度下（低于各自MIC，具體數(shù)據(jù)見表6～表8），對3 株致腐酵母菌起到協(xié)同或部分協(xié)同的作用，更好地抑制腐敗酵母菌的生長繁殖。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.5.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析 以發(fā)酵液中添加的山梨酸（A）、納他霉素（B）和二甲基二碳酸鹽（C）的質(zhì)量濃度為自變量（按果重百分比計），發(fā)酵30 d后發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為響應(yīng)值，建立3 因素3 水平中心組合試驗設(shè)計，以優(yōu)選復(fù)配抑菌劑用量，結(jié)果如表9所示。

利用Design Expert8.0.6 軟件對表9進(jìn)行多元回歸擬合分析。通常微生物指標(biāo)測定存在一定誤差，得到的模型回歸決定系數(shù)相對較低，故利用軟件對回歸模型進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)發(fā)酵30 d 發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為Y，得到回歸方程為：

表9 響應(yīng)面方案設(shè)計及試驗結(jié)果Table 9 Response surface scheme design and test results

Y=4.60?0.18A+0.14B?0.34C?0.093AB+0.63AC?0.14BC+0.38A2?0.48B2+0.34C2+0.33A2B+0.72A2C。對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表10所示。

從表10可以看出，該模型顯著（P<0.05），失擬項P=0.3280>0.05 不顯著，回歸模型決定系數(shù)R2=0.9740，說明方程對該試驗擬合程度良好。試驗變異系數(shù)CV=4.84%，模型重現(xiàn)性較好。綜上所述，可以用該模型對發(fā)酵30 d 后三華李果發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)進(jìn)行分析與預(yù)測。

表10 回歸模型方差分析Table 10 Analysis of variance of regression model

2.5.2 最佳抑菌劑組合濃度驗證試驗 利用Design Expert 8.0.6 軟件得出最佳抑菌劑復(fù)配濃度為：山梨酸質(zhì)量濃度0.040%，納他霉素質(zhì)量濃度0.010%，二甲基二碳酸鹽質(zhì)量濃度0.015%，在此條件下，預(yù)測發(fā)酵30 d 后三華李果發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為3.141 lg CFU/mL。進(jìn)行3 次驗證實驗，測得發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為3.212 lg CFU/mL，與預(yù)測值相比，相對誤差為2.26%，說明可以用該模型優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行抑菌劑的復(fù)配。

由前期實驗可知，發(fā)酵30 d 后，三華李發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)超過107CFU/mL 數(shù)量級時，發(fā)酵液表面會產(chǎn)生白色菌膜。在添加優(yōu)選復(fù)配抑菌劑后，發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)能控制在103CFU/mL 左右，發(fā)酵正常無白色菌膜產(chǎn)生。

3 討論與結(jié)論

新鮮水果表面通常攜帶大量微生物，在溫濕度適宜的條件下，容易導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。適當(dāng)?shù)募庸け２胤椒ǎ軌蜓娱L果品的食用期限，并增添風(fēng)味。李媛等[8]用復(fù)合乳酸菌發(fā)酵保藏三華李果，已取得了一定的效果，但存在發(fā)酵不穩(wěn)定、腐敗微生物生長難控制的情況。本文從發(fā)酵30 d 的表面長出白色菌膜的三華李異常發(fā)酵液中分離出3 株優(yōu)勢腐敗酵母菌，分別為假絲酵母亞種（Candida stellimalicola），庫德里阿茲氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和西方畢赤酵母（Pichia occidentalis）。石明楊[23]從沙果和桃子中分離得到能夠耐受低pH 的菌株，鑒定為畢赤酵母屬的Pichasp.。鐘小廷等[24]研究也發(fā)現(xiàn)畢赤酵母屬是引起泡菜“生花”的主要微生物。敖曉琳等[25]對“生花”的四川泡菜中的微生物進(jìn)行分離，鑒定得到的3 株腐敗酵母菌分別為P.manshurica、P.kudriavzevii和C.tropicalis，并且發(fā)現(xiàn)前兩種菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生腐敗味。張瑜等[26]發(fā)現(xiàn)引起發(fā)酵蔬菜表面形成膜醭的菌種包括近平滑假絲酵母、光滑假絲酵母和粗壯假絲酵母。可以看出酵母菌是導(dǎo)致泡菜表面“生花”的主要微生物，結(jié)果與本文相似。結(jié)合朱寒冰、Cassanego等[27?28]的研究可知，這些酵母屬于氧化性酵母，適度生長對發(fā)酵制品影響不大，但大量生長會在發(fā)酵制品表面出現(xiàn)成片或成碎花狀的白膜，產(chǎn)生白膜的發(fā)酵產(chǎn)品有異味，同時這些酵母會分解果蔬中的果膠物質(zhì)，消耗其中的糖類，導(dǎo)致發(fā)酵果蔬軟化腐爛，最終不能食用[26,29]。

三華李鮮果采收后，由于運輸儲藏的條件較差、時間較長等問題，可能導(dǎo)致果表面的初始腐敗菌數(shù)量較多，在發(fā)酵液中接入常量的乳酸菌無法完全殺滅及抑制腐敗菌的生長，導(dǎo)致發(fā)酵液表面產(chǎn)生白色菌膜等問題。發(fā)酵前處理如紫外、臭氧和高溫殺菌可以降低腐敗菌的數(shù)量和發(fā)酵異常的風(fēng)險，但通過前期預(yù)實驗表明，紫外線、臭氧殺菌處理在增加工序的同時殺菌效果不太理想，對于大規(guī)模果坯加工來說，成本較高；高溫殺菌會造成果坯變軟，不利于完整果形的保持。故本文采取分離鑒定腐敗菌，并針對性添加抑菌劑的方式來改善原有工藝，實施起來更為方便。本文利用牛津杯實驗得知，3 種抑菌劑均對3 株腐敗酵母菌產(chǎn)生顯著的抑菌圈，僅二甲基二碳酸鹽對發(fā)酵所用干酪乳桿菌有輕微的抑制作用，說明3 種抑菌劑可以用于抑制發(fā)酵液中腐敗酵母菌生長而不影響正常發(fā)酵。通過微量二倍稀釋法可知，納他霉素對3株致腐酵母菌有極強的抑制和殺死能力，3.91～7.81 μg/mL 就能抑制腐敗酵母菌的生長，濃度達(dá)到31.25 μg/mL 時可以完全殺死腐敗酵母菌；二甲基二碳酸鹽對三種腐敗酵母菌的MIC 為125～250 μg/mL。李東等[30]研究發(fā)現(xiàn)1.0～5.0 mg/kg 的納他霉素溶液能夠抑制多數(shù)酵母的生長。Sánchez-Rubio 等[31]研究表明二甲基二碳酸鹽對市售的一種脫醇紅葡萄酒中腐敗菌粘紅酵母和釀酒酵母的MIC 為200 mg/kg，研究結(jié)果與本文相似，均表明合適的抑菌劑能在低濃度下對酵母菌起到抑制作用。

抑菌劑復(fù)配使用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，增強抑菌效力[16]。本文利用棋盤法研究了3 種抑菌劑兩兩聯(lián)合使用對3 株致腐酵母的抑制作用，其中山梨酸與納他霉素聯(lián)合作用于6H7 菌株的FICI 為0.50；山梨酸與二甲基二碳酸鹽聯(lián)合作用于C2 和6H8 菌株的FICI 分別為0.50 和0.38，均表明抑菌劑聯(lián)合使用確有協(xié)同作用；根據(jù)以上結(jié)果，利用響應(yīng)面法優(yōu)化三華李果坯發(fā)酵過程的防腐工藝，得到復(fù)配抑菌劑參數(shù)為：在發(fā)酵液中按果重添加質(zhì)量濃度為0.040%山梨酸，0.010%納他霉素和0.015%二甲基二碳酸鹽，室溫密封發(fā)酵30 d 后，發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)為3.212 lg CFU/mL，遠(yuǎn)低于舊工藝發(fā)酵液中霉菌酵母活菌數(shù)，發(fā)酵液表面無白膜生長，果坯硬度高、無異味，工藝簡單有效、效果穩(wěn)定。