芋頭球蛋白的提取純化及其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

馬二蘭，林 瑩，涂 連，張 帆，王偉良

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

芋頭（Colocasia esciclenta（L.）Schott）又稱芋魁，俗名芋艿，天南星科魁芋屬多年生草本傳統(tǒng)藥食兩用植物[1]，世界各地均有種植，其中廣西荔浦芋較為出名，荔浦芋又名檳榔芋，個(gè)頭大、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富。芋頭球蛋白分為G1 和G2 兩種，各占可溶性蛋白的40%左右，一種凝集素Tarin，具有獨(dú)特的碳水化合物結(jié)合特性，芋頭的很多活性與其相關(guān)，另一種為蛋白酶抑制劑的Kunitz 家族，氨基酸測(cè)序證實(shí)其與胰蛋白酶抑制有關(guān)[2]。比如研究者發(fā)現(xiàn)中國(guó)臺(tái)灣的檳榔芋蛋白經(jīng)胃蛋白酶酶解后具有抗氧化活性和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用[3]，芋頭蛋白具有抗氧化[4]、調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤和抗菌生長(zhǎng)的能力[5]等活性。芋頭蛋白提取工藝研究較少，芋頭中活性蛋白一般采用含鹽緩沖液提取，將芋頭40 ℃以下烘干打粉[3]或?qū)⑿迈r芋頭打漿[6]，4 ℃提取，硫酸銨鹽析即可分離出蛋白質(zhì)，童晶晶等[7]比較了幾種提取溶劑，發(fā)現(xiàn)鹽提蛋白胰蛋白酶抑制活性最高，黃友如等[8]采用分級(jí)提取Osborne 分級(jí)法芋艿蛋白，其中清蛋白的提取率為43.38%。本文采用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（含0.3 mol/L NaCl，pH=6.8）的方法提取芋頭球蛋白，芋頭球蛋白占可溶性蛋白的80%左右，且文獻(xiàn)[2]中報(bào)道的酶抑制活性與球蛋白有關(guān)，因此可初步認(rèn)為本研究提取純化所得活性蛋白即為球蛋白。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能催化水解淀粉和低聚糖，引起餐后血糖升高[9?10]。Kumari 等[11]提取純化芋頭蛋白，發(fā)現(xiàn)其能非競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-淀粉酶，70 ℃仍然保留較高活性，最適pH6.9，有研究表明塊莖植物中抑制α-淀粉酶抑制活性蛋白也能抑制α-葡萄糖苷酶[12]，分子量一般為11～25 kDa 之間[13]，與芋頭中球蛋白的分子量相近，因此猜測(cè)芋頭球蛋白也有抑制活性，Sharma 等[14]從芋頭中提取純化得到兩種α-淀粉酶抑制活性蛋白，能抵抗蛋白酶的酶解，與Mcewan等[13]發(fā)現(xiàn)芋頭蛋白一樣對(duì)α-淀粉酶抑制作用為選擇性抑制。

芋頭功能和營(yíng)養(yǎng)特性已經(jīng)研究了半個(gè)世紀(jì)，芋頭蛋白具有一定的生物活性[1]，國(guó)內(nèi)對(duì)蛋白類α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑提取工藝研究較少，而國(guó)外研究了芋頭蛋白對(duì)α-淀粉酶抑制活性卻對(duì)提取工藝沒有對(duì)比與優(yōu)化。因此，本文采用磷酸緩沖液提取芋頭球蛋白，優(yōu)化提取工藝，經(jīng)DEAE-52 離子纖維素柱層析純化得到高活性組分，高效液相檢測(cè)純度，SDS-PAGE 電泳測(cè)分子量，測(cè)等電點(diǎn)，研究其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性以評(píng)價(jià)其體外血糖調(diào)節(jié)活性，并通過酶抑制動(dòng)力學(xué)初步研究作用機(jī)理，為進(jìn)一步分析活性蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)、研究其體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖活性奠定基礎(chǔ)，有望指導(dǎo)功能食品的研發(fā)，提高芋頭產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮廣西荔浦芋頭 于秋末采摘自南寧百貨超市；豬胰腺α-淀粉酶（9 U/mg）、阿卡波糖（500 mg）A9281 北京索萊寶科技有限公司；酵母α-葡萄糖苷酶（50 U/mg） 南京都萊生物技術(shù)有限公司；可溶性淀粉 廣州光華科技股份有限公司；對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑

均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為二級(jí)水。

Infinite M200 pro 酶標(biāo)儀 奧地利TECAN 公司；KND 系列凱氏定氮儀和消化爐 浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芋頭蛋白的提取

1.2.1.1 芋頭蛋白的提取工藝 提取工藝[15]：挑選完好、新鮮的芋頭洗凈去皮，切成1 cm3小塊，按料液比1:15 mg/mL（干基）加入含0.3 mol/L 氯化鈉的0.1 mol/L 磷酸緩沖液，于榨汁機(jī)中勻漿5 min，35 ℃恒溫水浴提取2 h，4℃下5000 r/min 離心15 min，上清液置于冰浴中，緩慢加入硫酸銨至80%飽和度，邊加邊輕輕攪拌，避免局部高濃度硫酸銨引起蛋白變性，離心得蛋白沉淀，溶于10 倍體積的磷酸緩沖液，輕輕搖勻使溶解充分，所得蛋白液轉(zhuǎn)入截留分子量3500 kDa 的透析袋中，置于裝有蒸餾水的大燒杯在4 ℃冰箱透析36 h，每6 h 換一次水，凍干得粗蛋白粉。芋頭總蛋白含量和粗蛋白中的總蛋白含量測(cè)定參照GB 5009.5-2016 中凱氏定氮法，提取蛋白含量采取考馬斯亮藍(lán)法[16]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白質(zhì)標(biāo)曲為y=0.2019x+0.0037（R2=0.9995，其中x 為吸光度，y 為蛋白濃度）。蛋白質(zhì)提取率、得率和純度計(jì)算公式如下[17]：

1.2.1.2 芋頭蛋白提取工藝單因素實(shí)驗(yàn) 設(shè)定基本條件為料液比1:15 g/mL，溫度35 ℃，提取時(shí)間2 h，次數(shù)2 次，改變其中一個(gè)條件，分別考察各因素對(duì)蛋白提取率的影響[18]：料液比取1:5、1:7.5、1:10、1:12.5、1:15、1:17.5、1:20 （g/mL），溫度取25、30、35、40、50、60、70 ℃，提取時(shí)間取30、60、90、120、150、180 min，次數(shù)取1、2、3、4 次。

1.2.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化芋頭蛋白提取工藝 選取料液比、提取溫度和提取時(shí)間為因素，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)Box-Behnken 試驗(yàn)[19]，每組重復(fù)3 次，因素及水平如表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface methodology

1.2.2 芋頭蛋白的純化 采用DEAE-52 纖維素離子交換層析柱[20]對(duì)芋頭蛋白進(jìn)行初步純化。填料按照說明書中方法處理好，裝入層析柱（2.6 cm×50 cm）自然沉降，關(guān)柱調(diào)節(jié)流速至0.3 mL/min 平衡12 h，上樣5.0 mL 濃度40 mg/mL 的芋頭蛋白質(zhì)溶液，待蛋白質(zhì)溶液與填料上端平齊后，關(guān)柱，靜置吸附1 h，以含氯化鈉濃度0、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 的磷酸緩沖液洗脫，流速0.2 mL/min，15 min/管，40 管/組。分部收集器收集洗脫液，測(cè)OD280制作洗脫曲線，合并洗脫液，透析，冷凍干燥得純化后的芋頭球蛋白。

采用高效凝膠排阻色譜（GPC）[21]測(cè)蛋白質(zhì)純度，色譜條件：色譜柱SB-804HQ；流動(dòng)相5%甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫度25 ℃；流速0.5 mL/min。

1.2.3 芋頭球蛋白等電點(diǎn)和SDS-PAGE 電泳分析

1.2.3.1 芋頭蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[22]將芋頭球蛋白配成1.0 mg/mL 溶液，用不同濃度醋酸溶液配成不同pH 的溶液5.0 mL 于15 mL 離心管中，加入1.0 mL 蛋白溶液，4℃靜置1 h 后5000 r/min離心15 min，測(cè)上清液蛋白質(zhì)濃度，濃度最低說明沉淀量最大，即為等電點(diǎn)。

1.2.3.2 芋頭蛋白SDS-PAGE 電泳分析 配制1.0 mg/mL 蛋白質(zhì)溶液，加入4 倍非還原上樣緩沖液，混勻后1000 r/min 離心5 min，參考文獻(xiàn)[23]采用SDS-PAGE 電泳法，配制5%濃縮膠、12%分離膠，蛋白上樣量10 μL，80 V 電泳至濃縮膠與分離膠的分界線處，改為120 V 繼續(xù)電泳至分離膠底部，考馬斯亮藍(lán)染色30 min，快速脫色液脫色，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析電泳條帶。

1.2.4 芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究

1.2.4.1 芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 確定最佳反應(yīng)時(shí)間和α-淀粉酶濃度，使酶反應(yīng)的速率在0.03～0.25 ΔA/min 之間[24]。α-淀粉酶抑制活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法[25]，將0.25 mL 的α-淀粉酶移入25 mL 具塞試管，加入0.25 mL 酶液，0.25 mL 的蛋白質(zhì)溶液，陽(yáng)性對(duì)照以同體積1.0 mg/mL 阿卡波糖代替，37 ℃預(yù)熱10 min，加入10 mg/mL 的可溶性淀粉3.25 mL，水浴振蕩反應(yīng)10 min 后立即加入1.5 mL DNS 終止反應(yīng)，沸水浴5 min，流水冷卻，蒸餾水定容至25 mL，空白組及對(duì)照組以同體積PBS 代替，酶標(biāo)儀測(cè)540 nm 處吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制活性采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）比色法[26]，反應(yīng)體系采用96 孔板法，加入120 L PBS，20 μL 樣品溶液，陽(yáng)性對(duì)照以同體積1.0 mg/mL 阿卡波糖代替，20 μL 0.3 U/mL的α-葡萄糖苷酶，37 ℃預(yù)熱10 min，加20 μL 2.5 mmol/L pNPG 反應(yīng)30 min，加1.0 mol/L 碳酸鈉終止反應(yīng)，測(cè)410 nm 處吸光度，抑制率公式如下。

1.2.4.2α-淀粉酶活性抑制動(dòng)力學(xué)研究 參考文獻(xiàn)[27]方法稍有改動(dòng)，不同酶濃度（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL）下測(cè)定球蛋白作用下的反應(yīng)速率，繪制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。固定酶濃度為0.5 mg/mL，測(cè)定不同底物濃度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL 時(shí)芋頭球蛋白作用下的反應(yīng)速率，作雙倒數(shù)曲線判斷抑制類型，求抑制常數(shù)Ki。

1.2.4.3α-葡萄糖苷酶活性抑制動(dòng)力學(xué)研究 參考文獻(xiàn)[28]方法稍有改動(dòng)，不同酶濃度（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 U/mL）下測(cè)球蛋白作用下的反應(yīng)速率，繪制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。測(cè)不同pNPG 濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 時(shí)的反應(yīng)速率，作雙倒數(shù)曲線判斷抑制類型，求抑制常數(shù)Ki。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，采用Design-Expert8.0.6 軟件、SPSS17.0、Excel2010 和Origin8.0 軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋頭蛋白的提取

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn) 如圖1，隨著料液比的提高，蛋白質(zhì)提取率先增加后趨于穩(wěn)定，因?yàn)榱弦罕鹊奶岣呖梢栽黾釉吓c提取溶劑的接觸面積，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，但料液比超過1:15 g/mL 后，不僅會(huì)增加雜質(zhì)溶出，溶液中鹽離子增多可能使蛋白變性，且導(dǎo)致蛋白濃度過低不利于后續(xù)的鹽析，因此選取1:15 g/mL為宜。如圖2，溫度對(duì)蛋白質(zhì)的提取率影響較大，低于25 ℃不利于蛋白質(zhì)溶出，高于60 ℃可能引起淀粉糊化而包裹住蛋白質(zhì)阻礙其溶出，40 ℃之前提取率隨溫度急劇變化，之后趨于穩(wěn)定，70 ℃時(shí)提取率降低，可能是因?yàn)榈矸酆鞍自陔x心時(shí)除去，為保證活性和提取率選取40 ℃作為提取溫度。如圖3，蛋白質(zhì)提取率隨提取時(shí)間先增加后降低，蛋白質(zhì)的提取率與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間少于60 min 時(shí)蛋白質(zhì)沒有充分溶出，導(dǎo)致提取不夠充分，而時(shí)間超過150 min 蛋白質(zhì)可能會(huì)變性沉淀而在離心中除去，因此，選取120 min 作為提取時(shí)間。如圖4，提取2 次以后，蛋白質(zhì)提取率增加變緩慢，表明大部分蛋白質(zhì)已充分提取，因此，選取2 次作為提取次數(shù)。

圖1 料液比對(duì)芋頭球蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of taro globulin

圖2 溫度對(duì)芋頭球蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the taro globulin extraction rate

圖3 時(shí)間對(duì)芋頭球蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on taro globulin extraction rate

圖4 次數(shù)對(duì)芋頭球蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on taro globulin extraction rate

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化芋頭蛋白提取工藝 根據(jù)Box-Benhnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。使用Design Expert 8.0.6 分析和擬合后得芋頭蛋白的提取率（Y）對(duì)料液比（A）、提取溫度（B）和提取時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response urface methodology

Y(%)=36.62+1.20A+0.51B+0.94C?0.18AB?0.36AC?0.20BC?2.70A2?0.36B2?1.10C2

如表3進(jìn)行顯著性分析，模型回歸P<0.0001，失擬項(xiàng)0.0662>0.05，表明殘差由隨機(jī)誤差引起，模型復(fù)決定系數(shù)R2=0.9971，所以模型可解釋99.71%的響應(yīng)值變化，模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.9933，與R2接近，表明模型具有充分性和準(zhǔn)確性。由表中F值可知三因素對(duì)提取率的影響：A>C>B，即料液比>提取時(shí)間>提取溫度，一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AC 和二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著（P<0.01）；交互項(xiàng)BC 顯著（P<0.05）；其他均不顯著。

由圖5反映的是第三個(gè)因素處于零水平判斷另外兩個(gè)因素的交互作用，隨料液比和溫度的增加，提取率先提高后降低，提取率隨溫度的變化幅度小于料液比，交互作用不顯著；隨料液比和提取時(shí)間的增加，提取率先提高后降低，在幾何中心點(diǎn)達(dá)到最大，交互作用顯著，隨提取時(shí)間和提取溫度，提取率在溫度提高時(shí)變化不大，隨提取時(shí)間增加提取率快速提高后趨于平緩，兩者的交互作用較顯著，這與表3中AC 的交互作用最顯著一致，即料液比和時(shí)間對(duì)提取率的交互影響最大。最優(yōu)提取條件的確定及驗(yàn)證：將回歸方程對(duì)A、B、C 分別取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，得到最佳條件為料液比15.67:1 mL/g、溫度41.33 ℃、時(shí)間124 min，此時(shí)的提取率為36.88%±0.25%，考慮實(shí)際操作將其修正為料液比16:1 mL/g、溫度41 ℃、時(shí)間124 min，為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，得提取率為36.75%±0.31%，和預(yù)測(cè)值吻合良好，表明此模型可用。童晶晶[15]采用鹽提法提取香芋蛋白，提取率為55.68%，常銀子等[29]采用酶法提取芋艿分離蛋白的提取率為10.20%，芋頭蛋白的提取率與芋頭品種和提取方法有關(guān)，本研究蛋白提取率相對(duì)較高，可用于活性蛋白的提取。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interaction of various factors

2.2 芋頭蛋白的純化

由圖6和表4可知，芋頭粗蛋白經(jīng)DEAE-52 纖維素層析柱后得四個(gè)洗脫組分，其中0.1 mol/L 氯化鈉洗脫組分蛋白含量最高，由含量可求出得率為0.20%±0.01%，且活性最高，可作為活性蛋白進(jìn)一步研究。

圖6 DEAE-52 纖維素層析柱純化芋頭球蛋白洗脫曲線Fig.6 Elution curve of taro globulin purified by deae-52 ion exchange chromatography

表4 DEAE-52 纖維素柱層析不同鹽濃度洗脫組分的蛋白質(zhì)含量和酶抑制活性Table 4 Protein content and enzyme inhibitory activity of elution components with different salt concentrations on DEAE-52 cellulose column chromatography

由圖7和表5可知，芋頭蛋白純化洗脫曲線中共有4 個(gè)吸收峰，在20.078 min 處有一主峰，經(jīng)計(jì)算得該峰對(duì)應(yīng)蛋白的純度為93.27%，表明蛋白純化效果較好。

表5 芋頭蛋白提取率和純度Table 5 Extraction rate and purity of taro protein

圖7 芋頭球蛋白經(jīng)純化在HPLC 流出曲線Fig.7 Taro globulin HPLC outflow curve after purified

2.3 芋頭蛋白等電點(diǎn)和SDS-PAGE 電泳分析

2.3.1 芋頭蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 如圖8，pH=5.6 時(shí)上清液蛋白濃度最低，說明此時(shí)蛋白沉淀量最大，即為芋頭球蛋白等電點(diǎn)，在Damares 等測(cè)得的芋頭球蛋白G1 等電點(diǎn)（pI）為5.5～9.5 內(nèi)[30]。

圖8 上清液球蛋白濃度隨pH 變化曲線Fig.8 Curve of globulin concentration in supernatant with pH

2.3.2 芋頭蛋白SDS-PAGE 電泳分析 如圖9所示，芋頭粗蛋白分子量為12、22、40、55 和63 kDa，純化后得到電泳純的球蛋白，分子量為22 kDa 左右，與文獻(xiàn)[2]中具有蛋白酶抑制活性的芋頭球蛋白的分子量一致。Sharma 等[14]提取純化得到的兩種具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白的分子量為14.3 和12.5 kDa，文獻(xiàn)[30]中報(bào)道的一種芋頭球蛋白也由12.5 kDa 的同型亞基組成，其與很多活性有關(guān)。童晶晶[15]比較了不同提取溶劑的分子量，發(fā)現(xiàn)Tris提取物所含條帶最多，胰蛋白酶抑制活性最強(qiáng)，表明一定濃度的緩沖液能促進(jìn)蛋白溶出且蛋白種類保留率高，本文采用的磷酸緩沖液提取的蛋白條帶也較多，說明可用于活性蛋白的提取。

圖9 芋頭球蛋白電泳圖Fig.9 Electropherogram of taro globulin

2.4 芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究

2.4.1α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定 由圖10、圖11可知，隨著芋頭球蛋白濃度增加，其對(duì)兩種酶的抑制活性均增強(qiáng)，且呈良好的量效關(guān)系。利用SPSS 軟件求出芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶的IC50為（0.75±0.10） mg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為（2.09±0.19） mg/mL，阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的IC50為（0.61±0.13） mg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為（0.69±0.16） mg/mL。芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶的抑制活性與阿卡波糖相當(dāng)，而對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性低于阿卡波糖。

圖10 芋頭球蛋白和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.10 Inhibitory effects of taro globulin and acarbose on α-amylase

圖11 芋頭球蛋白和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.11 Inhibitory effects of taro globulin and acarbose on α-glucosidase

2.4.2 芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究 參照文獻(xiàn)[27,31]能夠確定芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶的抑制作用類型，由抑制動(dòng)力學(xué)曲線圖12、圖13可知，加入不同濃度蛋白時(shí)所得的直線交于原點(diǎn)，且隨蛋白濃度增加斜率減少，說明芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均為可逆抑制，且圖14、圖15的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)，因此推測(cè)芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，蛋白與酶通過形成復(fù)合物來抑制酶，該復(fù)合物阻斷活性位點(diǎn)或改變酶的構(gòu)象，最終導(dǎo)致其催化活性降低，與文獻(xiàn)一致[11]。由表6的雙倒數(shù)曲線方程可以求得芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶抑制的Ki=（0.61±0.05） mg/mL，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的Ki=（0.26±0.02） mmol/L，說明芋頭球蛋白對(duì)兩種酶的抑制活性均較高。

表6 芋頭球蛋白與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線方程Table 6 Lineweaver-Burk plots equation of the reactions of α-amylase and α-glucosidase with taro globulin

圖12 芋頭球蛋白對(duì)α-淀粉酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.12 Inhibitory kinetic curve of taro globulin on α-amylase

圖13 芋頭球蛋白對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.13 Inhibitory kinetic curve of taro globulin on α-glucosidase

圖14 芋頭球蛋白與α-淀粉酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線Fig.14 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-amylase with taro globulin

圖15 芋頭球蛋白與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線Fig.15 Lineweaver-Burk plots of the reactions of α-glucosidase with taro globulin

3 結(jié)論

芋頭不僅提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還是天然活性物質(zhì)的主要來源。本研究從芋頭中提取純化得到一種球蛋白，發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有較高的抑制活性，存在量效關(guān)系，且純化后活性明顯提高，抑制類型均為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，表明芋頭球蛋白具有一定的體外調(diào)節(jié)血糖活性，但還需進(jìn)一步對(duì)球蛋白進(jìn)行鑒定、研究構(gòu)效關(guān)系和體內(nèi)作用機(jī)制。另外，可進(jìn)一步對(duì)其體內(nèi)消化進(jìn)行研究；或者酶解蛋白得到活性肽，對(duì)生物活性肽片段進(jìn)行后續(xù)分離、純化和測(cè)序研究，應(yīng)用于保健食品、食品配料或其他類型的食品。