基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討預(yù)知子抗抑郁的作用機(jī)制

錢慧琴，彭 媛，黃秀秀，于舒雁，劉冰冰，王 寧，趙永恒

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州黃河護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450066；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院，湖北十堰 442000）

抑郁癥是一種僅次于心血管疾病的第二大慢性疾病[1]，同時(shí)也是全球最常見的致殘?jiān)蛑?。常見臨床癥狀是以抑郁情緒、興趣喪失、精力減少等為主，嚴(yán)重影響人的思想，情緒和身體健康[2]。目前，臨床治療抑郁癥多以西藥為主，盡管它可以起到較好的治療作用，但易出現(xiàn)惡心、嘔吐、口腔潰瘍、焦躁不安等不良反應(yīng)[3]。中藥對(duì)抑郁癥的治療雖起效緩慢，但是卻很少發(fā)生不良反應(yīng)[4]，因此，從中藥中尋找抗抑郁藥已成為當(dāng)代藥學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

預(yù)知子，又名八月札、八月瓜、野香蕉等，為木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Decne.、三葉木通fAkebia trifoliata（Thunb.）Koidz.或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz.var.australis（Diels）Rehd.的果實(shí)。果實(shí)鮮甜可口，維生素C、氨基酸和蛋白含量較高，具有提高免疫力，延緩衰老等保健作用[5?7]，具有較高的食用價(jià)值。預(yù)知子作為中藥使用，能疏肝理氣，活血止痛，散結(jié)，利尿[8]。中醫(yī)臨床認(rèn)為有疏肝理氣的中藥具有抗抑郁的作用[4]。中醫(yī)臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)預(yù)知子及其復(fù)方消郁顆粒治療抑郁癥療效較好[9]，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其提取物可通過調(diào)控神經(jīng)可塑性相關(guān)蛋白的水平而具有抗抑郁作用[10]。然而其抗抑郁的活性成分及作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將多向藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)整合的一種新的藥物研究方法，從“多成分，多靶點(diǎn)，多通路”的角度全面系統(tǒng)地探討中藥治療疾病的作用機(jī)制。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示預(yù)知子抗抑郁的物質(zhì)作用基礎(chǔ)和作用機(jī)制，為抑郁癥藥物的研發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/），UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/），GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（ https://www.genecards.org/），STRING 平臺(tái)（https://string-db.org/），DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），Cytoscape 3.6.0 軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)知子活性成分收集與篩選 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘預(yù)知子的化學(xué)成分，篩選并保存類藥性（DL）≥0.10，口服生物利用度（OB）≥20%的活性成分[11]，同時(shí)將未符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但生物活性較好的成分納入預(yù)知子活性成分。使用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取篩選活性成分的結(jié)構(gòu)的SDF 和SMILES 格式。

1.2.2 預(yù)知子抗抑郁靶點(diǎn)收集 將以上獲取的預(yù)知子有效成分分子結(jié)構(gòu)（sdf）和Smiles 格式分別導(dǎo)入基于藥效團(tuán)模型的藥物靶點(diǎn)的PharmMapper 和利用化學(xué)相似性預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中，預(yù)測(cè)預(yù)知子化合物作用靶點(diǎn)。為了獲取可靠性較高的靶點(diǎn)，只保留PharmMapper 中Norm fit score≥0.9[12]和Swiss TargetPrediction 中Probability≥0.5[13]的藥物靶點(diǎn)。

以“Depression”為關(guān)鍵詞從 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)收集抑郁相關(guān)靶點(diǎn)。采用Omicshare 平臺(tái)上的維恩圖工具找出抑郁相關(guān)靶點(diǎn)與活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的共同靶蛋白，即為預(yù)知子抗抑郁的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將預(yù)知子抗抑郁相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，物種設(shè)置為“homo spaiens”，最低相互作用閾值設(shè)為0.7，其余參數(shù)保持默認(rèn)值[14]。獲取預(yù)知子抗抑郁靶蛋白的互作關(guān)系（Protein-protein interactions,PPI）。

使用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)和PPI 網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)度（degree）值、介數(shù)（Betweenness Centrality）和接近中心性（Closeness Centrality）可用于評(píng)價(jià)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性。度值是指一個(gè)節(jié)點(diǎn)與多少個(gè)節(jié)點(diǎn)直接相連，與其他點(diǎn)連接的個(gè)數(shù)越多，介數(shù)是計(jì)算通過某個(gè)節(jié)點(diǎn)的最短路徑數(shù)，而接近中心性是指一個(gè)節(jié)點(diǎn)到其他節(jié)點(diǎn)的所有最短路徑之和的倒數(shù)。節(jié)點(diǎn)的度值、介數(shù)和接近中心性越大，說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越處于核心位置。一般節(jié)點(diǎn)度值，介數(shù)和接近中心性大于其平均值，則可被認(rèn)為該節(jié)點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)[15]。

1.2.4 信號(hào)通路與生物過程分析 將上述預(yù)知子抗抑郁關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的uniprit ID 導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（ KEGG）代謝通路和基因本位（ GO） 富集分析。

1.2.5 預(yù)知子核心活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接 從Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載預(yù)知子核心活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載核心靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。采用AutoDock vina 軟件實(shí)施活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接。采用Pymol 軟件將分值最低且具較好構(gòu)象的分子對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)知子化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選得到23 個(gè)活性成分，由于Calceolarioside B[16]和 akebonoic acid[17]的OB 值較低，F(xiàn)erulic acid[18]的DL 值較低，但是它們都具有較好的生物活性，故考慮將其納入分析，最終得到預(yù)知子活性成分26 個(gè)（見表1）。針對(duì)每個(gè)活性成分，通過PharmMapper 和Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選，共得到118 個(gè)化學(xué)成分靶點(diǎn)。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘到抑郁相關(guān)的靶點(diǎn)有8959 個(gè)。將118 個(gè)預(yù)知子有效成分靶點(diǎn)與8959 個(gè)抑郁相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，共得到95 個(gè)預(yù)知子抗抑郁靶點(diǎn)（見圖1）。

表1 預(yù)知子活性化合物基本信息Table 1 Detailed information of active compounds of Akebiae Fructus

圖1 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集的維恩圖Fig.1 Venn diagram after intersection of component targets and disease targets

預(yù)知子化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，圖2中圓形代表預(yù)知子化合物，三角形代表預(yù)知子抗抑郁靶點(diǎn)，共有121 個(gè)節(jié)點(diǎn)，500 條邊。由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹芍衔锏钠骄B接度值、介數(shù)和接近中心性分別為19.23、0.05 和0.41，說(shuō)明預(yù)知子化合物作用于多個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選，共有6 個(gè)重要活性成分，包括木通苯乙醇B （C1,degree=39）、硬脂酸甘油酯（C25,degree=31）、豆甾醇葡萄糖苷（C11,Degree=29）、齊墩果酸（C2,Degree=28）、西托糖苷（C3,Degree=25）、蝙蝠葛堿（C14,Degree=23），推測(cè)以上活性成分為預(yù)知子抗抑郁的核心有效成分。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)

將String 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的個(gè)蛋白互作關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.6.0 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3），圖3中共有76 個(gè)節(jié)點(diǎn)和174 條邊，經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治隹芍? 個(gè)靶點(diǎn)的度值、介數(shù)和接近中心性大于其平均值（4.58、0.03 和0.42），包括表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶1/8（MAPK1/8）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、熱休克蛋白HSP 90α（HSP90AA1）、雄激素受體（AR）、雌激素受體（ESR1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3），提示以上靶點(diǎn)是預(yù)知子治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI Network

2.3 通路富集分析

為了探究預(yù)知子抑郁癥相關(guān)靶點(diǎn)的GO 生物功能，通過DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)8 個(gè)預(yù)知子抗抑郁關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因的功能注釋及通路富集分析。以顯著性P<0.05 為篩選條件，共篩選出9 個(gè)生物過程（Biological Process），主要涉及應(yīng)激反應(yīng)（response to stress）、ERBB2 信號(hào)通路（ERBB2 signaling pathway）、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）等。4 個(gè)細(xì)胞組成（Cell Component），包括細(xì)胞核（nucleus）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、細(xì)胞溶質(zhì)（cytosol）等。9 個(gè)分子功能（Molecular Function），主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）等。預(yù)知子抗抑郁核心靶點(diǎn)的GO 富集分析結(jié)果見圖4。

圖4 GO 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

由KEGG 通路富集分析結(jié)果可知，以通路的顯著性P<0.05 為篩選條件，8 個(gè)核心靶點(diǎn)共富集32 條通路。排除疾病信號(hào)通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，共得到16 條與抑郁癥相關(guān)的通路。通過Omicshare 平臺(tái)中的氣泡圖進(jìn)行可視化，如圖5，圓點(diǎn)越大顏色越深，表明該通路富集的靶點(diǎn)數(shù)目越多，P值也越小。排名靠前信號(hào)通路的有催乳素信號(hào)通路（Prolactin signaling pathway）、ErbB 信號(hào)通路（ErbB signaling pathway）、GnRH 信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）、黏著斑（Focal adhesion）等，表明預(yù)知子的活性成分通過調(diào)節(jié)多靶點(diǎn)、多通路起到抗抑郁的效應(yīng)。

圖5 預(yù)知子抗抑郁通路的氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of anti-depression pathway of Akebiae Fructus

2.4 分子對(duì)接試驗(yàn)結(jié)果

以化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中篩選的核心化學(xué)成分木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿為配體，PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選的核心靶點(diǎn)EGFR、MAPK1、MAPK8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3 為受體，采用AutoDock vina 軟件實(shí)施分子對(duì)接。一般認(rèn)為分子對(duì)接的結(jié)合能越低，說(shuō)明配體與受體相互作用越高。據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，若配體和受體的結(jié)合能≤?5.0 kcal·mol?1則被認(rèn)為有效分子對(duì)接。由表2可知，除了硬脂酸甘油酯-ERFG的對(duì)接活性較弱外，其他47 對(duì)核心活性成分與靶蛋白（97.92%）均有較好的結(jié)合活性。其中，8 對(duì)核心活性成分與靶點(diǎn)（16.67%）的結(jié)合能均小于或等于?9.0 kcal/mol，顯示出較強(qiáng)的結(jié)合活性。值的注意的是，蝙蝠葛堿-MAPK1、豆甾醇葡萄糖苷-MAPK1、木通苯乙醇B-MAPK8 和木通苯乙醇B-MAPK1 的對(duì)接活性最好，如圖6可知，活性成分能夠比較好地嵌入到靶蛋白的活性口袋中，形成穩(wěn)定的構(gòu)象。

圖6 結(jié)合能最低的分子對(duì)接模式Fig.6 Docking mode with lowest binding energies

表2 預(yù)知子核心活性成分和核心靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 2 Binding energies of kenerl compounds and targets of Akebiae Fructus

3 討論與結(jié)論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接揭示預(yù)知子抗抑郁作用機(jī)制。通過構(gòu)建預(yù)知子“化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，篩選得到6 個(gè)核心活性成分，包括木通苯乙醇B、硬脂酸甘油酯、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain -derived neurotrophic factor,BDNF）參與情緒和認(rèn)知功能的關(guān)鍵腦回路中的神經(jīng)元的生存、生長(zhǎng)和維護(hù)。BDNF 的減少直接參與抑郁癥的病理生理過程[20]。齊墩果酸能夠增加海馬BDNF 水平而具有抗抑郁作用[21]。西托糖苷和豆甾醇葡萄糖苷均屬于甾體活性成分，在其四環(huán)核周圍的官能團(tuán)的作用下，具有廣泛的生物活性。有報(bào)道指出豆甾醇葡萄糖苷的苷元在小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、尾部懸掛試驗(yàn)和川芎嗪所致上瞼下垂、體溫過低和運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)中通過縮短小鼠靜止時(shí)間，增加小鼠運(yùn)動(dòng)活性、減少上瞼下垂、拮抗小鼠體溫下降而表現(xiàn)出顯著的抗抑郁作用[22]。西托糖苷的苷元的同分異構(gòu)體—β-谷甾醇通過增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的血清素和去甲腎上腺素水平而具有抗抑郁活性[23]。另外，分子對(duì)接結(jié)果顯示木通苯乙醇B、豆甾醇葡萄糖苷、齊墩果酸、西托糖苷和蝙蝠葛堿均能較好地嵌合到核心靶蛋白的活性口袋中。

由PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出8 個(gè)預(yù)知子抗抑郁核心靶點(diǎn)，包括EGFR、MAPK1/8、SRC、HSP90AA1、AR、ESR1、CASP3。EGFR 和HSP90AA1 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，而重度抑郁癥在腫瘤患者中很常見，是普通人群的患病率的4 倍[24?25]。因此，研究者發(fā)現(xiàn)EGFR 突變型非小細(xì)胞肺癌通過介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生抑郁情緒[26]，肝癌患者有中度/重度抑郁與HSP90AA1 上調(diào)相關(guān)[27]。I?iguez 等[28]發(fā)現(xiàn)大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，成年雄性Sprague-Dawley 大鼠海馬中MAPK1 過表達(dá)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗抑郁樣行為。另外，MAPK8 是成年海馬中神經(jīng)發(fā)生的中樞抑制因子，同時(shí)也是焦慮和抑郁樣行為的啟動(dòng)因子[29]。AR 可能通過改變miR-204-5p 的表達(dá)，調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)，從而影響慢性輕度應(yīng)激型小鼠的抑郁樣行為[30]。雌激素可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)換，提高血清素和去甲腎上腺素的水平，進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁的作用。而雌激素的生物功能在很大程度上是通過細(xì)胞內(nèi)激活其主要受體雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2）發(fā)揮的。因此，雌激素受體的遺傳變異在女性患抑郁癥的易感性發(fā)揮著重要作用[31?32]。有研究指出谷氨酸能系統(tǒng)的功能障礙和突觸可塑性的失調(diào)與抑郁癥有關(guān)[33]。海馬長(zhǎng)期抑郁是一種活躍的突觸可塑性，對(duì)空間記憶、情境性恐懼記憶和新穎性習(xí)得的鞏固具有重要作用，通過線粒體激活caspase-3 是海馬神經(jīng)元長(zhǎng)期抑郁和N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDR）內(nèi)化所必需的[34]。分子對(duì)接顯示以上大部分核心靶點(diǎn)與預(yù)知子核心活性成分具有較好的結(jié)合活性。

由KEGG 通路富集分析可知，核心靶點(diǎn)主要調(diào)控催乳素信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、GnRH 信號(hào)通路等信號(hào)通路。在催乳素信號(hào)通路中，有4 個(gè)預(yù)知子抗抑郁靶點(diǎn)參與調(diào)控。Jak/Stat 通路在催乳素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核心作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，在慢性輕度應(yīng)激抑郁癥模型中，通過抑制JAK2-STAT5 信號(hào)通路的激活，從而降低催乳素受體（Prolactin receptor，PRLR）表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，從而減輕慢性輕度應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁[35]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制的單胺假說(shuō)認(rèn)為抑郁癥是由大腦中突觸單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺）減少引起的[36]?；A(chǔ)研究表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子Neuregulin 1 （NRG1）及其受體ErbB酪氨酸激酶調(diào)節(jié)中腦多巴胺（DA）傳遞和腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的mglur1 依賴性長(zhǎng)期抑郁[37]。有研究指出下丘腦激素GnRH 刺激垂體的黃體生成素和卵泡生成素的分泌，這兩種激素反過來(lái)調(diào)節(jié)卵巢和睪丸的功能，而促性腺激素水平的變化會(huì)影響情緒，并有助于情感障礙的發(fā)展[38]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法初步探究預(yù)知子抗抑郁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，作用靶點(diǎn)和其調(diào)控的抗抑郁通路，發(fā)現(xiàn)預(yù)知子通過“多成分，多靶點(diǎn)，多通路”的作用機(jī)制而起到抗抑郁的效應(yīng)，這為后續(xù)預(yù)知子抗抑郁的分子作用機(jī)制提供了新思路和新方法。