苜蓿中15 種農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質譜確證方法研究

谷 旭，吳雨珊，高云峰，商方方，王 嬌，梁海軍*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部動物產(chǎn)品質量安全飼料源性因子風險評估實驗室，北京 100081；2.北京農(nóng)檢科技有限公司，北京 100193；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品和獸藥飼料技術鑒定站，黑龍江哈爾濱 150090）

苜蓿有“牧草之王”的稱號，是目前世界種植面積最大、可利用價值最高、分布最廣的牧草。苜蓿一年可收割4～7 次[1]，粗蛋白質含量可達18%，遠高于小麥、玉米等其他牧草，在草食家畜養(yǎng)殖中有著不可替代的地位。國家實施振興奶業(yè)苜蓿發(fā)展行動，帶動優(yōu)質苜蓿種植面積不斷擴大，質量快速提升，有力促進了苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。苜蓿為多年生植物，營養(yǎng)價值高，為病、蟲提供了一個相對穩(wěn)定適宜的環(huán)境，為提高產(chǎn)量使用農(nóng)藥成為去除病蟲草害不可避免的手段[2-7]。苜蓿生產(chǎn)中使用的化學農(nóng)藥有甲萘威、亞胺硫磷、異丙威等，使用最多的是有機磷類農(nóng)藥[8]。

殘留在苜蓿中的農(nóng)藥經(jīng)飼喂進入動物體，輕則影響畜禽生理健康和生產(chǎn)性能，嚴重可殘留在畜禽產(chǎn)品中，對人體健康構成潛在隱患。雖然對農(nóng)藥殘留檢測方法研究報道很多[9-12]，但國內(nèi)外對苜蓿中農(nóng)藥殘留檢測的研究較少[1]，對苜蓿中農(nóng)藥殘留情況更是鮮有報道，因而有必要開展苜蓿等飼草中的農(nóng)藥多殘留分析方法研究。液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）技術具有高分離性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點，近年來國內(nèi)[13-15]國外[16-17]許多農(nóng)藥殘留檢測均用LC-MS/MS 方法。利用LC-MS/MS 進行農(nóng)藥殘留檢測是分析領域的一個發(fā)展趨勢[18-19]，QuErChERS 有著可應用的農(nóng)藥范圍廣、回收率、準確度、精確度高等優(yōu)點[17,19]。本研究旨在建立一種有機溶劑提取、QuErChERS 技術凈化和LC-MS/MS 技術聯(lián)合檢測苜蓿中15 種農(nóng)藥殘留的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甲萘威、仲丁靈、樂果、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威15 種農(nóng)藥標準品純度均99%。試驗所用試劑包括乙腈為色譜純（美國Sigma Aldrich）、甲酸為色譜純（美國Dikma Pure）、均質子（天津Agela Technologies）、MS-MG5052 QuEChERS 鹽 包（50 mL，內(nèi)含6 g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉）和MS-9PP0264購自天津Agela Technologies，QuEChERS 凈化管（15 mL，內(nèi)含1 200 mg 無水硫酸鎂、400 mg PSA、60 mg PC、400 mg C18，MS-9PP0264）購自天津Agela Technologies、0.22 μm 尼龍針式過濾器。試驗用水均為超純水，風干苜蓿（2018 年5 月23 日播種，同年9 月28 日收割）來源于黑龍江省。

1.2 儀器與設備 APΙ 4000+液相色譜串聯(lián)質譜儀（美國SCΙEX）：配電噴霧離子源（ESΙ）；離心機（日本Hitachi）；渦旋混勻器（美國Scilogex）；分析天平（德國Sartorius）

1.3 溶液配制 標準溶液配制：分別取15 種農(nóng)藥（敵草隆、仲丁靈、樂果、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威）標準品0.2 mg 于燒杯中，用乙腈溶解，溶解液全部轉移至10 mL 的容量瓶中，燒杯用乙腈潤洗3 次，潤洗液全部轉移至容量瓶中，用乙腈定容，配制成濃度為20 mg/L 的標準儲備液，于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

混合標準液配制：上述15 種農(nóng)藥的標準儲備液，分別準確移取1 mL 至25 mL 容量瓶中并定容至25 mL，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為0.8 mg/L 的混合標準儲備液，于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱取2.00 g 經(jīng)粉碎后的苜蓿樣品于50 mL 離心管中（每個樣品3 個平行），加入10 mL 水浸泡并平衡2 min，加入10 mL 乙腈和4 顆均質子渦旋混勻1 min，在樣品中加入QuEChERS 萃取鹽包（50 mL，內(nèi)含6 g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉）劇烈振蕩1 min，然后經(jīng)8 000 r/min 離心10 min，分離提取液。

1.4.2 凈化 將5 mL 提取液轉移至15 mL QuEChERS 凈化管，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min 離心5 min，取0.5 mL上清液和0.5 mL 水置于1.5 mL 離心管中，渦旋混勻后，過0.22 μm 濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜測定和確證。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質譜條件

1.5.1 液相色譜條件色譜柱 Kinetex F5，2.6 μm，100 ?，3.0×50 mm；流動相：0.1% 甲酸的水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：30℃；液相色譜梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A-5%B；1.0～3.0 min，60%A-40%B；3.0～4.5 min，15%A-85%B；4.5～6.0 min，5%A-95%B；6.0～12.0 min，95%A-5%B。

1.5.2 質譜條件離子源 電噴霧電離子ESΙ（+），電噴霧電壓：5.5 kV，噴霧器壓力：50 Psi；氣簾氣壓力：10 Psi；輔助氣壓力：55 Psi。離子源溫度：500℃；采集模式：多反應監(jiān)測模式（MRM）。

1.6 方法驗證 在0.25～20 μg/L 內(nèi)配制敵草隆、仲丁靈、馬拉硫磷、樂果、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、三唑酮、烯唑醇、甲霜靈、甲基硫菌靈、嘧菌酯、多菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷、異丙威15 種混合標準使用液，按本試驗條件進行測定，擬合一次線性方程，標準溶液濃度（μg/L）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得到15 種農(nóng)藥分別對應的一次線性回歸方程。稱取2.0 g 空白基質樣品，采用基質加標的方法添加15 種農(nóng)藥，按照本試驗的處理方法與條件進行檢測，以3 倍基線噪聲（S/Ν=3）計算方法檢出限，以10 倍基線噪聲（S/Ν=10）計算方法定量限。

采用基質加標方式，配制混合標準溶液，以2.5、5、20、50、100、200 μg/kg 共6 個梯度分別加入各標準藥品，每梯度做 3 個重復，按照“1.4”進行前處理，按照“1.5”進行檢測，并計算加標回收率及相對標準偏差（RSD）。

1.7 基質效應測定 由于苜蓿樣品基質較為復雜，會對分析化合物的離子化程度產(chǎn)生很大影響，因此，本研究考察了苜?；|中分析化合物的基質效應，采用提取后添加法，添加水平為0.02 μg/mL，即基質加標。

參照“1.4”方法進行樣品前處理，制得空白基質溶液稀釋標樣作為基質標樣，該濃度的標準工作液作為溶劑標樣。按“1.5”色譜條件和工作方法進行分析測定，記錄各種農(nóng)藥的峰面積，按基質效應計算公式進行評價（如公式（1）所示）。若A/B＞1，則表示基質增強效應；若A/B＜1，則表示基質抑制效應；若A/B=1，則表示不存在基質效應。當A/B為0.8～1.2 時，基質干擾程度較低；當0.5 ＜A/B＜0.8 或 1.2 ＜A/B＜1.5 時，表現(xiàn)為中等程度的基質干擾效應；當A/B＜0.5 或A/B＞1.5，表示基質效應的干擾強烈。

式中，Mi為基質效應；A 為基質匹配標準品的峰面積；B 為純標準品的峰面積。

2 結果與分析

2.1 質譜條件選擇 將藥物標準溶液以流動注射的方式進樣，通過全掃描的方式確定其母離子。在對分子離子峰進行二級質譜掃描，得到碎片離子的二級質譜圖。針對不同目標化合物以多反應監(jiān)測（MRM）模式對其二級質譜的源內(nèi)裂解電壓、碰撞能量、離子駐留時間等參數(shù)進行優(yōu)化，使每種化合物的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大。選取豐度較高且較為穩(wěn)定的2 對特征碎片離子作為定性離子。優(yōu)化后的質譜條件見表1。

表1 15 種農(nóng)藥質譜參數(shù)

2.2 色譜條件選擇 在苜蓿樣品中分別加入15 種農(nóng)藥，通過“1.4”的方法進行前處理，再在“1.5”條件下進行檢測，15 種農(nóng)藥的保留時間分別是敵草隆4.18 min、仲丁靈5.3 min、樂果3.6min、甲萘威4.1 min、亞胺硫磷4.5 min、氧化萎銹靈3.8 min、三唑酮4.5 min、烯唑醇4.6 min、甲霜靈4.1min、甲基硫菌靈3.9 min、嘧菌酯4.5 min、多菌靈3.0 min、二嗪磷4.7 min、甲基異柳磷4.9 min、異丙威4.2 min。選擇離子流圖如圖1。

圖1 苜蓿中15 種農(nóng)藥MRM 色譜圖

2.3 線性范圍、檢出限與定量限 在0.25～20 μg/L 采用基質加標的方法添加15 種農(nóng)藥，以3 倍基線噪聲（S/Ν=3）計算方法檢出限，以10 倍基線噪聲（S/Ν=10）計算方法定量限。由表2 可知，15 種農(nóng)藥在0.25～～20 μg/L 線性關系良好，相關系數(shù)（R2）為0.997～0.999 9，檢出限（LOD）為0.01～0.5 μg/L，定量限為0.02～1.5 μg/L，符合多種農(nóng)藥殘留分析要求。

2.4 回收率及精密度 由表3 可知，當加標量為2.5 μg/kg時，除敵草隆、甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、異丙威和甲硫威外，其他目標化合物的加標回收率為85.5%～118.5%；RDS 除敵草隆、仲丁靈、甲萘威、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、多菌靈外，其他目標化合物的相對標準偏差在3.4%～19.3%。當加標量為5 μg/kg時，除甲基硫菌靈和多菌靈外，其余目標物的回收率在76.7%～100.7%；精密度除敵草隆和多菌靈外，其他目標物的相對標準偏差在2.1%～18.6%。當加標量為20 μg/kg時，15 種農(nóng)藥的加標回收率在86.7%～117.3%；相對標準偏差為0.9%～18.5%。當加標量為50 μg/kg 時，15 種目標化合物的加標回收率為85.4%～107.6%；相對標準偏差在4.6%～14.0%。當加標量為100 μg/kg 時，15 種目標物的回收率在83.4%～110.4%；相對標準偏差 為2.4%～9.9%。當加標量為200 μg/kg 時，15 種目標物的回收率在83.6%～112.9%；相對標準偏差為1.3%～13.6%。本試驗方法的回收率和相對標準偏差均滿足農(nóng)藥殘留分析方法要求。

表3 15 種農(nóng)藥的加標回收率結果和相對標準偏差（n=3）

2.5 方法的基質效應 由表4 可知，15 種農(nóng)藥中有14種的基質效應為30.9%～91.3%，表現(xiàn)為基質抑制效應；只有多菌靈的基質效應為126.0%，表現(xiàn)為基質增強。其中，仲丁靈、烯唑醇和甲霜靈受基質抑制干擾較低；敵草隆、樂果、三唑酮和嘧菌酯表現(xiàn)為中等程度的基質抑制效應，多菌靈為中等程度的基質增強效應；甲萘威、亞胺硫磷、氧化萎銹靈、甲基硫菌靈、二嗪磷、甲基異柳磷和異丙威均表現(xiàn)為強烈的基質抑制效應。

表4 15 種農(nóng)藥的基質效應 %

3 結論

綜上，利用QuErChERS 前處理技術結合液相色譜-串聯(lián)質譜法的分析方法進行苜蓿中15 種農(nóng)藥殘留分析檢測。該方法靈敏度高、簡便、快速、準確、有機溶劑消耗量少。馬建華等[13]對苜蓿進行五種農(nóng)藥的的殘留分析，相關系數(shù)0.899 5～0.994 1。本研究中，15 種目標物在0.25～20 μg/L，線性良好，相關系數(shù)（R2）為0.997～0.999 9，檢出限濃度在0.01～0.5 μg/L，定量限在0.02～1.5 μg/L，符合多種農(nóng)藥殘留分析要求。張亞男等[20]利用氣相色譜法測定韭菜中有機磷農(nóng)藥殘留平均回收率在78.5～106.7%，在加標量為50 以上時，本方法的平均回收率為83.4～117.3%?；厥章屎拖鄬藴势罹鶟M足農(nóng)藥多殘留分析檢測要求。另外，對苜蓿樣品檢測時的基質效應進行分析，檢測的15 種農(nóng)藥中12種農(nóng)藥受基質效應影響較大，其中4 種農(nóng)藥表現(xiàn)為中等程度的基質抑制效應，1 種農(nóng)藥表現(xiàn)為中等程度的基質增強效應干擾，其余的7 種農(nóng)藥表現(xiàn)為強烈的基質抑制效應。本次試驗利用基質空白匹配標準溶液進行定量分析，有效消除了基質效應帶來的影響，滿足苜蓿中農(nóng)藥殘留分析的要求。因此，在苜蓿樣品檢測過程中需利用基質匹配混合標準工作液的方法來消除或補償基質效應。本方法給我國苜蓿農(nóng)藥殘留的風險評估、進出口檢測等工作提供了一種準確的定量分析手段。