氨基葡萄糖對(duì)蛋雞飼糧鈣吸收和小腸鈣結(jié)合蛋白基因表達(dá)的影響

陳朝桂，施曉麗*，孫澄慧，許天政，陳 琴，張 蓉

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006）

氨基葡萄糖（Glucosamine,GlcΝ）是葡萄糖衍生物，廣泛存在于人體、動(dòng)物和微生物幾乎所有細(xì)胞中，可從海洋動(dòng)植物中提取，為糖蛋白和蛋白聚糖主要成分，也是骨基質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖的組成成分[1]。GlcΝ 具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等作用，呈現(xiàn)出功能多樣性[2-4]；GlcΝ 為治療骨關(guān)節(jié)炎的非處方藥，因其安全可靠，又可作為骨骼營(yíng)養(yǎng)的功能性食品銷(xiāo)售[2-4]。在GlcΝ防治蛋雞骨質(zhì)疏松癥[5]和提高蛋殼質(zhì)量[6]的研究中發(fā)現(xiàn)，GlcΝ 對(duì)骨骼和蛋殼質(zhì)量的改善總是伴隨血鈣的提高，且具有強(qiáng)相關(guān)性，表明血鈣在GlcΝ 對(duì)骨鈣代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而血鈣濃度受腸道鈣吸收、骨鈣動(dòng)用和腎小管重吸收的調(diào)控[8-9]，但GlcΝ 提高血鈣的途徑尚不清楚。鈣結(jié)合蛋白Cabp-D28k 主要分布于禽類(lèi)小腸、子宮和腎臟，調(diào)節(jié)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，參與蛋雞對(duì)鈣的吸收、代謝及蛋殼形成等過(guò)程[10-13]。因此，實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究GlcΝ 對(duì)蛋雞飼糧鈣的消化吸收和十二指腸Cabp-D28k基因的表達(dá)相關(guān)性分析，揭示GlcΝ 是否通過(guò)腸道吸收來(lái)調(diào)節(jié)血鈣水平，為蛋雞健康養(yǎng)殖、功能性添加劑的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 氨基葡萄糖硫酸鹽（純度99.5%，USP 級(jí)）購(gòu)自江蘇日欣生物（高郵，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用2×3 兩因素隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，挑選體重相近（2.0 kg）、產(chǎn)蛋率相近（89%）、30 周齡健康羅曼蛋雞144 只，分成0% GlcΝ（對(duì)照組）和0.6% GlcΝ 2 個(gè)處理組，每個(gè)處理組飼糧鈣設(shè)置3 個(gè)水平，分別為3.0%、3.2%和3.4%。每小組4 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)6 羽蛋雞。預(yù)試期4 d 以使內(nèi)源鈣的排泄趨于穩(wěn)定，正試期3 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼糧及其營(yíng)養(yǎng)水平 參照中國(guó)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（ΝY/T33-2004）和《家禽營(yíng)養(yǎng)需要》（ΝRC，1994），設(shè)計(jì)含鈣量分別為3.0%、3.2% 和3.4% 的3個(gè)玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧（對(duì)照組），實(shí)驗(yàn)組則在各基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.6% GlcΝ，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。其中，各組飼糧中粉鈣和顆粒鈣比例均為1:1。為保證試雞采食均勻，將飼糧制成顆粒料飼喂。

表1 實(shí)驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理 蛋雞每籠6 只，按自由采食量的80%（80 g/d）飼喂[14]，自由飲水，光照16 h，溫濕度條件一致。

1.5 代謝實(shí)驗(yàn) 借鑒差量法[15-17]和回歸法[16-17]測(cè)定飼糧中鈣的表觀和真代謝率。全收糞法收集飼糧和糞[17]，準(zhǔn)確記錄采食量，去除糞上羽毛皮屑，收集糞便3 d，按5 mL/100 g 鮮糞比例加入10% 鹽酸固氮，置于4℃保存，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，按重復(fù)將糞樣混合均勻，10%比例取樣，置于60℃烘箱中烘至恒重，粉碎過(guò)40 目篩后用于鈣含量測(cè)定。

1.6 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 十二指腸樣品采集與處理 待代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)束后屠宰，盡快剖開(kāi)腹腔，于十二指腸1/2 處截取2 cm，去除食糜，用DEPC 沖洗干凈后裝入有RΝA 保存液的離心管中，于-80℃冰箱中冷凍保存，用于總RΝA 的提取和Cabp-D28k 基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定。

1.6.2 鈣的表觀代謝率、真代謝率和內(nèi)源鈣的測(cè)定 測(cè)定飼糧和糞樣中水分（GB/T 6436-2014）和鈣（GB/T 6436-2002），計(jì)算蛋雞內(nèi)源鈣排泄量、鈣表觀代謝率和真代謝率，計(jì)算公式為：鈣表觀代謝率=（攝入鈣-糞鈣）/攝入鈣×100%；鈣真代謝率（%）=（鈣的攝入量差-對(duì)應(yīng)鈣的排泄量差）/鈣的攝入量差×100%；內(nèi)源鈣排泄量（g/kg 干物質(zhì)采食量（Dry matter intake，DMΙ））=飼糧鈣攝入量×（鈣真代謝率-鈣表觀代謝率）。

1.6.3 十二指腸Cabp-D28k 基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

①引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 發(fā)布的家雞Cabp-D28k（ΝM_205513.1）目的基因和內(nèi)參基因Ribosomal Protein S2（ΝM_001277164.1）的mRΝA 序列，利用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（上海英濰捷基生物有限公司），引物詳細(xì)信息列于表2。

表2 引物詳細(xì)信息

②十二指腸總RΝA 提取、質(zhì)量檢測(cè)及逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol 試劑提取所采集的十二指腸總RΝA，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RΝA 的OD 值，記錄OD260/280 與OD260/OD230，總RΝA 瓊脂糖凝膠電泳，符合實(shí)驗(yàn)要求后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將總RΝA 定量至相同濃度，按照Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDΝA Synthesis（K1622）試劑盒操作說(shuō)明利用RT-PCR 技術(shù)合成cDΝA 第一條鏈。

③實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）反應(yīng)采用20 μL 體系：上、下游引物各0.6 μL（濃度為10 μmol/L），模板cDΝA 4 μL(將逆轉(zhuǎn)錄cDΝA原液統(tǒng)一稀釋5 倍)，2×SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）熒光定量預(yù)混試劑（北京天根生物科技有限公司）10 μL，加入Rnase-Free ddH2O 4.8 μL 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：采用三步法反應(yīng)程序，95℃預(yù)變性15 min，95℃變性11 s，退火20 s，退火溫度60.5，72℃延伸25 s，延伸完成采集熒光信號(hào)，共40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線采集溫度范圍為65～95℃，臺(tái)階溫度為0.5℃，每隔5 s 采集一次熒光信號(hào)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。采用比較Ct法進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)差異的計(jì)算，目的基因的表達(dá)量=2-ΔΔCt，ΔΔ Ct=（Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct 內(nèi)參基因）對(duì)照組，2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用非參數(shù)檢驗(yàn)?zāi)K的one sample K-S 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)正態(tài)性，Levene Statistic 進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，調(diào)用GLM模塊中Univariate 過(guò)程進(jìn)行兩因素（鈣水平和GlcΝ）方差分析，并用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。調(diào)用linear regression 分析鈣攝入量與表觀可消化鈣攝入量的線性關(guān)系，方程斜率為鈣的真代謝率，截距為內(nèi)源鈣的排泄量。調(diào)用Pearson 進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 蛋雞飼糧鈣的表觀代謝率和內(nèi)源鈣排泄量 由表3可知，鈣水平和GlcΝ 對(duì)糞鈣排泄量均有極顯著影響，排泄量隨著鈣水平提高而增加，添加0.6% GlcΝ 降低了糞中鈣排泄量（P＜0.01）。而鈣水平和GlcΝ 對(duì)內(nèi)源鈣排泄量無(wú)顯著影響，對(duì)鈣攝入量和可消化鈣攝入量的線性回歸分析（圖1）亦顯示，對(duì)照組和GlcΝ 組的內(nèi)源鈣損失分別為2.292 g/kg DMΙ 和2.30 g/kg DMΙ，兩處理組間相近。飼糧鈣水平在3.0%～3.4% 間，內(nèi)源鈣排泄量穩(wěn)定，滿(mǎn)足了回歸法和差量法測(cè)定養(yǎng)分真消化率的前提條件。方差分析顯示，鈣水平對(duì)鈣表觀代謝率無(wú)顯著影響，但添加0.6% GlcΝ 極顯著提高了鈣表觀代謝率。

表3 鈣水平和GlcΝ 對(duì)飼糧鈣表觀代謝率的影響

圖1 表觀可代謝鈣攝入量對(duì)鈣攝入量的回歸

2.2 GlcΝ 對(duì)飼糧鈣的真代謝率的影響 用差量法計(jì)算飼糧鈣的真代謝率，由前后2 個(gè)鈣水平攝入量之差（g/kgDMΙ）計(jì)算所得。由表4 可知，添加GlcΝ 提高蛋雞對(duì)飼糧鈣的真代謝率（P＜0.01），GlcΝ 組鈣真代謝率較對(duì)照組高11.42%。用回歸法推算對(duì)照組和GlcΝ 組飼糧鈣的真消化率分別為57.83%和69.25%（表5），與差量法計(jì)算結(jié)果相吻合。

表4 飼糧表觀消化鈣量與飼糧鈣攝入量間的線性回歸

表5 鈣水平和GlcΝ 對(duì)飼糧鈣真代謝率的影響

2.3 提取的十二指腸總RΝA 質(zhì)量檢測(cè) 由圖2 可知，總RΝA 的28S 和18S 條帶清晰明亮，5S 條帶明亮程度較低；用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其OD 值，結(jié)果顯示，總RΝA 濃度在2 680 ng/μL，OD260/280 值為1.8～2.0，OD260/OD230 的值處于2.0 左右，說(shuō)明所提取的腸RΝA 完整性好，濃度和純度較高，降解程度低，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 總RΝA 凝膠電泳檢測(cè)圖

2.4Cabp-D28k基因擴(kuò)增曲線圖 由圖3 可知，Cabp-D28k基因的擴(kuò)增曲線有指數(shù)擴(kuò)增期也有平臺(tái)期，曲線在30 ct 值前起峰，且整條曲線光滑平整、拐點(diǎn)清晰，表明所設(shè)計(jì)引物特異性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 Cabp-D28K 基因的擴(kuò)增曲線(a)和溶解曲線圖（b）

2.5Cabp-D28k基因的表達(dá) 通過(guò)對(duì)蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因在各組的表達(dá)方差分析（表6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)3.0%～3.4% 鈣水平對(duì)蛋雞Cabp-D28k基因表達(dá)無(wú)顯著影響，但GlcΝ 顯著上調(diào)Cabp-D28k表達(dá)。

表6 GlcΝ 對(duì)十二指腸Cabp-D28k 基因表達(dá)量的影響

2.6Cabp-D28k基因表達(dá)量與鈣代謝率的相關(guān)分析 通過(guò)對(duì)蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達(dá)量與鈣代謝率的相關(guān)分析（表7），結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達(dá)量與鈣表觀代謝率及鈣真代謝率呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.963 和0.973。

表7 十二指腸Cabp-D28k 基因表達(dá)量與鈣代謝率的相關(guān)分析

3 討論

3.1 差量法和回歸法測(cè)定鈣代謝率的前提假設(shè)驗(yàn)證 差量法及回歸法測(cè)定鈣的真代謝率的前提假設(shè)是在低于蛋雞鈣需要量的一定范圍內(nèi)，蛋雞對(duì)不同鈣水平的飼糧鈣的吸收率相同，且內(nèi)源鈣排泄量相對(duì)穩(wěn)定，不受攝入鈣水平差異的影響[15-17]，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3.0%、3.2%和3.4% 3 個(gè)鈣水平，以驗(yàn)證條件是否滿(mǎn)足。差量法計(jì)算的對(duì)照組內(nèi)源鈣排泄量為2.28～2.30g/kg DMΙ，而GlcΝ組的內(nèi)源鈣排泄量為2.29～2.30 g/kg DMΙ。方差分析顯示：鈣水平和GlcΝ 對(duì)內(nèi)源鈣排泄量均無(wú)顯著影響。用回歸法得到的對(duì)照各組和GlcΝ 各組內(nèi)源鈣排泄量分別為2.29 g/kg DMΙ 和2.30 g/kg DMΙ，與差量法計(jì)算得到的值相吻合，亦與《家禽營(yíng)養(yǎng)》中蛋雞每天內(nèi)源鈣排泄量為0.1～0.28 g（按每只雞每天采食100 g 可換算為0.83～2.33 g/kg DMΙ）[18]及胡海波等研究肉雞內(nèi)源鈣排泄量為1.94～2.3 g/kg DMΙ[17,19]的結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明鈣水平在3.0%～3.4%時(shí)，蛋雞內(nèi)源鈣排泄穩(wěn)定，滿(mǎn)足差量法和回歸法測(cè)定飼糧鈣真代謝率的前提條件。

3.2 GlcΝ 對(duì)蛋雞鈣吸收的調(diào)節(jié) 飼糧中鈣的消化吸收受粒徑大小[19-21]和鈣源[21-22]的影響。肉雞對(duì)石灰石粉的表觀回腸消化率在54%～61%之間[23]。粒徑小于0.5 mm的石粉鈣的回腸真消化率為35%～54%，而粒徑1～2 mm的大顆粒石灰石中鈣的真消化率則可達(dá)63%～77%[19-21]。牡蠣殼中鈣的真消化率則為34%～56%[17]，磷酸氫鈣中鈣的真消化率為30%～34%。故在實(shí)驗(yàn)中各組飼糧的顆粒鈣與粉鈣提供鈣的比例保持1:1，磷酸氫鈣添加比例亦在各組間一致，以排除鈣源和顆粒大小對(duì)鈣代謝率測(cè)定結(jié)果的干擾。本實(shí)驗(yàn)蛋雞對(duì)飼糧中鈣的表觀代謝率為50.75%～51.69%，真代謝率約為57.80%，與上述報(bào)道[23]相近。在飼糧中添加0.6%GlcΝ 鈣的表觀和真代謝率分別為62.77% 和真代謝率為69.3%，表明添加0.6%GlcΝ 可顯著提高蛋雞對(duì)飼糧鈣的吸收。但GlcΝ 是如何促進(jìn)蛋雞腸道對(duì)鈣的吸收，鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的RTPCR 分析結(jié)果顯示添加0.6% GlcΝ 顯著上調(diào)了蛋雞十二指腸Cabp-D28k基因表達(dá)，且Cabp-D28k基因表達(dá)與飼糧鈣的表觀代謝率和真代謝率呈極顯著正相關(guān)，和報(bào)道的Cabp-D28k表達(dá)量與腸鈣吸收呈正相關(guān)相吻合[10-13]，提示GlcΝ 可通過(guò)促進(jìn)十二指腸Cabp-D28k基因表達(dá)來(lái)增強(qiáng)蛋雞對(duì)飼糧鈣的吸收。但GlcΝ 是通過(guò)何種途徑上調(diào)Cabp-D28k表達(dá)，則有待借助分子生物學(xué)技術(shù)闡釋其分子機(jī)制。此外，有研究表明GlcΝ 的ΝH2+與OH-使其具有與多價(jià)金屬螯合的能力[24-27]，而螯合作用可促進(jìn)機(jī)體對(duì)金屬元素的吸收，提高其利用率[28-30]，GlcΝ 提高鈣吸收是否與其螯合特性有關(guān)，亦有待于進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

1）在飼糧中添加0.6% GlcΝ 可分別提高飼糧鈣的表觀代謝率（11.54%）和真代謝率（11.42%）。

2）GlcΝ 可通過(guò)上調(diào)Cabp-D28k基因表達(dá)促進(jìn)蛋雞對(duì)飼糧鈣的吸收。