不同解凍程序?qū)s昌豬冷凍精液解凍效果的影響

甘麥鄰，劉 麟，趙 雪，鄭 婷，郭宗義，沈林園，潘紅梅，張 亮，王金勇*，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611130；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

動(dòng)物人工授精技術(shù)可以極大提升優(yōu)秀種公畜的利用效率和利用空間，故被稱(chēng)作家畜繁殖領(lǐng)域的第一次革命，而精液冷凍技術(shù)則可以突破時(shí)空限制進(jìn)一步放大優(yōu)秀種公畜的影響[1]。牛、羊等少數(shù)畜種精液冷凍技術(shù)較為成熟，已經(jīng)得到大范圍推廣和應(yīng)用，而豬的精子脂質(zhì)含量高，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)特殊，導(dǎo)致豬精子的抗凍性較差，精液冷凍后存活率低、凍精配種受胎率低，在商業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制[2]。當(dāng)前，豬應(yīng)用冷凍精液進(jìn)行人工授精的比例不足1%[3]。

冷凍精液除了面臨冷凍過(guò)程的低溫打擊，還要面臨解凍過(guò)程的復(fù)蘇傷害[4]。豬精液冷凍和復(fù)蘇過(guò)程同樣經(jīng)歷了“固態(tài)——液態(tài)”2 種形態(tài)的轉(zhuǎn)變，因此豬冷凍精液的解凍過(guò)程與豬精液冷凍過(guò)程非常重要[8]。長(zhǎng)期以來(lái)，研究人員將主要精力集中于降低精子冷凍過(guò)程的低溫打擊[5]，并開(kāi)發(fā)出了一系列降低精子低溫打擊的方法[6]和相關(guān)冷凍保護(hù)劑[7]，對(duì)豬冷凍精液的解凍研究相對(duì)缺乏。榮昌豬是世界八大優(yōu)良豬種之一，主產(chǎn)于重慶榮昌和四川隆昌兩地，具有早熟、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、性情溫馴和肉品質(zhì)好等特點(diǎn)，是我國(guó)地方品種中西南型的主要代表豬種之一。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同解凍液、不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)榮昌豬冷凍精液解凍效果的影響，使用因子分析法評(píng)估和篩選不同解凍液適用的最佳解凍程序，以期為榮昌豬資源保護(hù)和推廣利用相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 如無(wú)特殊說(shuō)明，所用試劑均購(gòu)自索萊寶科技有限公司（北京），精液為健康榮昌豬的0.25 mL細(xì)管冷凍精液。

1.2 解凍液配制 商業(yè)解凍液M（Androhep? CryoGuard Thaw Extender，Mintub，德國(guó)）按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制。自配解凍液J 和C 為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳育種團(tuán)隊(duì)結(jié)合前期研究和查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上自行配制[8]，配方見(jiàn)表1。

表1 自配解凍液配方 g

1.3 解凍方法 將凍精細(xì)管從液氮中取出后迅速放入提前預(yù)熱的恒溫水浴鍋（32、37、42、47、52℃），按下計(jì)時(shí)鍵（記10 s 或20 s），并緩慢攪動(dòng)水浴，待計(jì)時(shí)器報(bào)警，立即從水浴中取出凍精細(xì)管，用干凈的紙巾擦干細(xì)管。剪開(kāi)細(xì)管的兩端，使解凍融化的精液自行流入干凈容器，按1:9 的比例將凍融精液與解凍液混合。從凍融精液與解凍液混合時(shí)開(kāi)始計(jì)算凍精解凍后的保存時(shí)間。將與解凍液凍混合的凍融精液分為2 份，1 份置于37℃水浴中孵育，待測(cè)。另1 份放入17℃恒溫箱保存24 h 后檢測(cè)。

1.4 精子指標(biāo)檢測(cè) 使用前在37℃載物臺(tái)對(duì)計(jì)數(shù)板進(jìn)行預(yù)熱，將解凍后的精液樣品緩慢注入計(jì)數(shù)待檢計(jì)數(shù)室，使之均勻流入整個(gè)計(jì)數(shù)室，再在顯微鏡下觀察并使用精子自動(dòng)分析系統(tǒng)（AndroVision，Minitube，德國(guó)）分析精子活率、活力快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)等指標(biāo)。

1.5 最適解凍溫度和時(shí)間篩選 分別于精液解凍后3、6、9、12、15、18、21、24、30 min 及1、24 h 檢測(cè)精子在不同條件（32℃ 20 s；37℃ 10 s；37℃ 20 s；42℃10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s；47℃ 20 s 和52℃ 10 s）下解凍后精子的凍后活力、活率、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子率和慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子比率。為便于因子分析結(jié)果的描述，將冷凍精液解凍后的最高活率所對(duì)應(yīng)的精子活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速解凍精子定義為即時(shí)精子指標(biāo)，將解凍后17℃保存24 h 的精子活率和活力記為精子保存指標(biāo)，記錄10 個(gè)不同解凍時(shí)間對(duì)應(yīng)高于40%活率數(shù)、活力高于30%數(shù)，記為精子持續(xù)指標(biāo)。

1.6 因子分析步驟 ①收集和處理數(shù)據(jù)；②計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣；③使用主成分分析法提取因子，計(jì)算分析特征值1 的主成分貢獻(xiàn)率；④采用正交旋轉(zhuǎn)法獲得成分得分系數(shù)矩陣；⑤利用成分得分系數(shù)矩陣求得各主成分得分；⑥進(jìn)一步使用特征值1 的主成分的總體貢獻(xiàn)率百分比作為權(quán)重計(jì)算綜合得分。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用WPS office 進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理和整理，使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行因子分析篩選不同解凍液對(duì)應(yīng)的最適解凍溫度和時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍液M 對(duì)精子凍后質(zhì)量的影響 如圖1 所示，解凍液M 對(duì)不同解凍溫度和解凍時(shí)間解凍的精子活率和活力均呈緩慢下降，快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子呈快速下降趨勢(shì)，而慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)隨解凍時(shí)間延長(zhǎng)基本維持。3 個(gè)條件下（37℃ 10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s）解凍的精子置于17℃保存24 h，仍有高于30% 的活率。此外，本研究所設(shè)各種解凍溫度以10 s 或20 s 解凍后，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)無(wú)典型的隨溫度或時(shí)間變化而變化的趨勢(shì)。

圖1 解凍液M 不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)解凍后精子活率的影響

2.2 解凍液J 不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)精子指標(biāo)的影響如圖2 所示，使用解凍液J 進(jìn)行解凍時(shí)，不同解凍溫度和解凍時(shí)間條件下解凍的精液每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果也表明解凍后的精子指標(biāo)無(wú)典型隨解凍溫度或解凍時(shí)間變化而變化的特征。使用解凍液J 進(jìn)行解凍時(shí)不同解凍溫度和解凍時(shí)間程序解凍的精子活率、活力和快速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)均呈現(xiàn)緩慢先上升后下降的變化趨勢(shì)，慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)在解凍后30 min 內(nèi)基本維持在相近水平。

圖2 解凍液J 不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)解凍后精子活率的影響

2.3 解凍液C 不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)精子指標(biāo)的影響如圖3 所示，使用解凍液C 進(jìn)行解凍時(shí)，與解凍液M和J 類(lèi)似，以不同程序解凍的精子，其凍后精子的每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)也無(wú)典型隨解凍溫度或解凍時(shí)間變化而變化的特征。使用解凍液C 進(jìn)行解凍后的精子各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)隨時(shí)間變化與解凍液M 相似，而不同于解凍液J。此外，慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)在30 min 內(nèi)呈緩慢增加趨勢(shì)。

圖3 解凍液C 不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)解凍后精子活率的影響

2.4 3 種解凍液對(duì)解凍后精子指標(biāo)的影響 從圖4 中可以看出，解凍液M 解凍后的精子活率和精子活力曲線可與解凍液M 和C 分離，顯示出更好的效果。此外解凍液C 解凍后隨時(shí)間推移精子活率、活力和快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子下降速度快于解凍液M 和J。

圖4 不同解凍液不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)解凍后精子活率的影響

2.5 不同解凍液最適解凍溫度和時(shí)間篩選 從旋轉(zhuǎn)成分矩陣（表2）可以看出，解凍液M 第1 主成分主要反映保存指標(biāo)和持續(xù)指標(biāo)（47℃ 10 s 最高），第2 主成分主要反映即時(shí)指標(biāo)（47℃ 20 s 最高），第3 主成分主要反映慢速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子（37℃ 20 s 最高）；解凍液J 第1 主成分主要反映即時(shí)指標(biāo)和持續(xù)指標(biāo)（32℃ 20 s最高），第2 主成分主要反映保存指標(biāo)（42℃ 10 s 最高）；解凍液C 第1 主成分主要反映持續(xù)指標(biāo)（32℃20 s 最高），第2 主成分主要反映即時(shí)指標(biāo)（52℃ 10 s最高），第3 主成分主要反映活力和快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子（52℃ 10 s 最高）。計(jì)算綜合得分，顯示解凍液M 和J 最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 最適解凍方式為32℃ 20 s。利用因子分析計(jì)算得到的最適解凍溫度和時(shí)間，則解凍后的精子指標(biāo)在3 種解凍液中差距進(jìn)一步縮?。▓D6）。

圖6 不同解凍液不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)解凍后精子活率的影響

表2 不同解凍液不同解凍溫度和時(shí)間旋轉(zhuǎn)成分矩陣

圖5 不同解凍液不同解凍溫度和時(shí)間對(duì)應(yīng)綜合指數(shù)

3 討論

3.1 不同解凍液對(duì)榮昌豬精液冷凍后解凍效果的影響使用合適的方法和手段使豬精子在液氮中固態(tài)保存時(shí)存活固然重要，而使液氮中存活的精子成功復(fù)蘇也非常重要。解凍液成分不同是影響解凍效果的主要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，3 種不同解凍液在相同的解凍程序下，最高解凍活率之間相差8.17%，最高解凍活力相差7.13%。

冷凍精液目前主要有低溫緩慢解凍（5℃）、室溫中速解凍（15℃）、體溫快速解凍（37～40℃）以及高溫超快速解凍（50℃以上）等解凍方式[9]，不同畜種冷凍精液的解凍溫度又各有不同。目前豬的冷凍精液報(bào)道的最低解凍溫度為37℃，最高解凍溫度為70℃[10]，而牛的冷凍精液可以在90℃高溫下解凍[11]。盡管有不少研究認(rèn)為，高溫超快速解凍效果較好[12]，但需要精確控制時(shí)間，且因?yàn)樨i人工授精所需精子量通常在40 億～80 億，而常用的0.25 mL 和0.5 mL 規(guī)格凍精一支僅含1 億～2 億精子，因此一次配種需要同時(shí)解凍多份冷凍精液，難以保證解凍時(shí)間的一致性，很容易因時(shí)間控制不精確而燙傷精子[13]，因此不建議在實(shí)際生產(chǎn)中使用高溫超快速解凍[14]。本試驗(yàn)中3 種不同解凍液的不同解凍溫度和時(shí)間的解凍曲線不能完全分離，表明32～52℃是一個(gè)較為溫和的溫度范圍，能夠獲得較為穩(wěn)定的解凍效果。本研究中，解凍精子的各項(xiàng)性狀并沒(méi)有隨著不同解凍溫度和解凍時(shí)間而表現(xiàn)出規(guī)律性的上升或下降。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，豬冷凍精液解凍后精子指標(biāo)快速下降，至1 h 左右時(shí)下降到最高水平的60%左右，而置于17℃保存精液24 h 后精子各項(xiàng)指標(biāo)較1 h 更高，因此豬冷凍精液解凍后應(yīng)當(dāng)快速使用，當(dāng)不能立即使用時(shí)，最好保持在17℃放置更有利于精子活力的維持[15]。

3.2 不同解凍液最適解凍溫度和時(shí)間的篩選方法構(gòu)建豬精液解凍后，通常并不能即刻輸入母豬體內(nèi)，且精子在母豬生殖道仍然需要時(shí)間運(yùn)動(dòng)到合適位置，因此解凍后精子需要維持一定的活率和活力[16]。針對(duì)部分條件較差的豬場(chǎng)，往往還需要解凍后進(jìn)行一段時(shí)間的運(yùn)輸，因此可能需要短期儲(chǔ)存。為評(píng)價(jià)豬冷凍精液保存效果，將冷凍精液解凍后的最高活率所對(duì)應(yīng)的精子活力、快速前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子和慢速解凍精子定義為即時(shí)精子指標(biāo)；將17℃保存24 h 的精子活率和活力記為保存指標(biāo)；記錄10 個(gè)不同解凍時(shí)間對(duì)應(yīng)高于40%活率數(shù)，和活力高于30%數(shù)，記為持續(xù)指標(biāo)。由于本研究中所用豬冷凍精液解凍后在17℃繼續(xù)保存24 h 后的精子活率和活力已經(jīng)很低，快速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)和慢速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)比例更低，會(huì)導(dǎo)致誤差較大，且現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)指標(biāo)重點(diǎn)關(guān)注豬精子活力[17]，未對(duì)本研究涉及其他指標(biāo)做要求。因此，本研究模型中未將這些指標(biāo)納入分析，后續(xù)如果有需要可以將這些指標(biāo)一并納入分析。

經(jīng)計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，解凍液M 和J 的最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 的最適解凍方式為32℃ 20 s，利用通過(guò)因子分析計(jì)算得到的最適解凍溫度和時(shí)間進(jìn)行解凍，發(fā)現(xiàn)解凍后的精子指標(biāo)在3 種解凍液之間的差距進(jìn)一步縮小，各指標(biāo)進(jìn)一步提升，表明使用通過(guò)綜合分析篩選最佳解凍程序后可進(jìn)一步挖掘解凍液潛力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用不同解凍液在解凍榮昌豬冷凍精液時(shí)具有不同的最適解凍溫度和時(shí)間，解凍液M和J 最適解凍方式為42℃ 20 s；解凍液C 最適解凍方式為32℃ 20 s。針對(duì)不同解凍液最佳解凍程序不同，通過(guò)綜合分析可進(jìn)一步發(fā)掘解凍液潛力，降低生產(chǎn)浪費(fèi)并提升經(jīng)濟(jì)效益。