生物信息技術(shù)篩選雞空腸和盲腸的差異基因

樊慶燦

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000）

腸道具有轉(zhuǎn)運(yùn)和消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)、排泄廢物、維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能，并在細(xì)胞和體液免疫、機(jī)體解毒和自愈等方面發(fā)揮重要作用[1]。雞（Gallus domesticus）腸道包括小腸和大腸。小腸分為十二指腸、空腸和回腸，是消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所。大腸是由一對(duì)盲腸和直腸組成，盲腸后腸壁有豐富的淋巴組織形成盲腸扁桃體。目前，雞腸道相關(guān)的分子研究雖然較多，但集中在腸道微生物方面[2-4]，空腸和盲腸組織的分子研究較少。Bertocchi 等[5]利用雞空腸和盲腸組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選腸道不同部位的差異表達(dá)基因，從分子水平探討空腸和盲腸新功能。本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expressioni Omnibus，GEO）中的數(shù)據(jù)，研究雞空腸和盲腸的差異表達(dá)基因，討論空腸和盲腸對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收作用和分子機(jī)理。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究所用數(shù)據(jù)來自于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)為GSE124066（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi）。19 只體重均等的Ros308 公雞（42 d）屠宰后采集空腸和盲腸黏膜組織，利用GeneChip Chicken 1.0 ST Array（Affymetrix，Santa Clara，California，USA），測(cè)定空腸和盲腸各基因的表達(dá)量。

1.2 分析方法 將GSE124066 輸入到BART（http://igc1.salk.edu:3838/bart/）的相應(yīng)數(shù)據(jù)框中，平臺(tái)類型為GPL19014，分組依據(jù)選擇組織，所用的數(shù)據(jù)類型選擇CEL 數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)上傳后，BART 會(huì)首先對(duì)原始數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)矩陣進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)換并做標(biāo)準(zhǔn)化。接下來做PCA 主成分分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，矯正后用LΙMMA做差異分析。分析完成后下載標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)量表、基因表達(dá)差異表和火山圖。在Excel 中將adj.P＜0.05 且|logFC|＞1 的轉(zhuǎn)錄本稱為差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（Differentially Expressed Transcripts，DETs），對(duì)應(yīng)的基因作為差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。將logFC＞1 和logFC＜-1 的DEGs 分別導(dǎo)入STRΙΝG（https://string-db.org/cgi/input.pl? sessionΙd=ΝPdug dyy2MoP &input_page_show_search=on）、Cytoskype 3.6.0 的BΙΝGO 插件和DAVΙD 6.8（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）中，進(jìn)行蛋白互作分析、生物過程富集分析和KEGG 分 析。把STRΙΝG 中combine score＞0.7的互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoskype 中繪制互作圖，利用cytoHubb 插件Betweenness 法篩選互作圖中的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)結(jié)果 結(jié)果顯示在空腸中表達(dá)上調(diào)的DETs共677 個(gè)（logFC＜-1），對(duì) 應(yīng)517 個(gè)可識(shí)別DEGs。在盲腸中表達(dá)上調(diào)的DETs 共660 個(gè)（logFC＞1），對(duì)應(yīng)534 個(gè)可識(shí)別DEGs。其中差異倍數(shù)大于6 的DEGs 見表1，其中空腸上調(diào)的DEGs 共10 個(gè)，載脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）為差異倍數(shù)最大的DEG，此外包括4 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和5 個(gè)代謝相關(guān)酶。4 個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)橐朁S醇結(jié)合蛋白2（Retinol Binding Protein 2，RBP2）、脂溶性載體家族6A19（Solute Carrier Family 6 Member 19，SLC6A19）、脂溶性載體家族15A1（Solute Carrier Family 15 Member 1，SLC15A1）和脂溶性載體家族7A9（Solute Carrier Family 7 Member 9，SLC7A9）。5 個(gè)代謝相關(guān)酶為谷氨酸谷氨氨肽酶（Glutamyl Aminopeptidase，EΝPEP）、甲基多巴α亞基（Meprin A Subunit Alpha，MEP1A）、蔗糖酶異麥芽糖酶復(fù)合物（Sucrase-Ιsomaltase，SΙ）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（Angiotensin Ι Converting Enzyme 2，ACE2）和麥芽糖酶葡糖淀粉酶（Maltase-Glucoamylase，MGAM）。盲腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 為2 個(gè)，胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine Beta-Synthase，CBS）為差異倍數(shù)最大的基因，其次為T 細(xì)胞分化相關(guān)蛋白（T Cell Differen tiation Protein，MAL）。

表1 表達(dá)差異倍數(shù)大于6 的DEGs

將空腸中517 個(gè)和盲腸中534 個(gè)DEGs 分別進(jìn)行互作分析和核心基因篩選，圖1 為部分基因的互作網(wǎng)絡(luò)圖。其中空腸（圖1-a）DEGs 互作網(wǎng)絡(luò)中的5 個(gè)核心基因分別為APOB、載脂蛋白A1（Apolipoprotein A1，APOA1）、骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原1（Bone Marrow Stromal Cell Antigen 1，BST1）、黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白2（Recombinant Melanotransferrin2，MFΙ2）和RBP2，其中APOB和RBP2為差異倍數(shù)大于6 的DEGs。盲腸（圖1-b）DEGs 互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因?yàn)橹芷谝蕾嚨鞍准っ?（Cyclin Dependent Kinase 1，CDK1）、細(xì)胞分裂周期蛋白20（Cell Division Cycle 20，CDC20）、絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶1（Polo Like Kinase 1，PLK1）、正核分裂周期蛋白80（Νuclear Division Cycle 80，Νdc80）和微小染色體維持復(fù)合物5（Minichromosome Maintenance Complex Component 5，MCM5）。

圖1 空腸和盲腸的部分DEGs 互作圖

2.2 空腸和盲腸DEGs 聚類分析 對(duì)空腸和盲腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 進(jìn)行生物過程的GO 分析，空腸和盲腸中最為顯著的10 個(gè)條目見表2。在空腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 主要聚集在脂、醚、酒精、小分子代謝和跨膜運(yùn)輸，其中脂代謝條目為P值最小條目，聚集在此條目的DEGs 有23 個(gè)。此外，篩選出多條脂代謝相關(guān)條目。盲腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 主要聚集在機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞周期相關(guān)的條目，其中多細(xì)胞有機(jī)發(fā)育是P值最小的條目，聚集在此條目的DEGs 有74 個(gè)。此外，篩選出多條機(jī)體發(fā)育相關(guān)的條目。

表2 空腸和盲腸DEGs 生物過程分析的部分結(jié)果（前10 項(xiàng)）

對(duì)空腸和盲腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 進(jìn)行KEGG 分析，P＜0.01 的信號(hào)通路見圖2。在空腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 參與PPAR 信號(hào)通路（03320）、代謝通路（01100）、過氧化物體（04146）、脂肪酸代謝（01212）和脂肪酸降解（00071）信號(hào)通路，其中PPAR 信號(hào)通路是P值最小的信號(hào)通路，有18 個(gè)DEGs 參與該通路。在盲腸中表達(dá)上調(diào)的DEGs 參與細(xì)胞周期（04110）、黏附斑信號(hào)通路（04510）、ECM-受體互作通路（04512）、硫代謝（00920）、抗生素合成（01130）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（00270）信號(hào)通路，其中細(xì)胞周期是P值最小的信號(hào)通路，共有14 個(gè)DEGs 參與該通路。

圖2 空腸和盲腸DEGs 信號(hào)通路分析部分結(jié)果

3 討論

本研究篩選出空腸中的表達(dá)上調(diào)的DEGs，從分子水平證實(shí)了空腸的生理功能。差異基因中MGAM編碼的酶蛋白可作為α-淀粉酶活性降低時(shí)的替代酶，SΙ編碼蛋白則在碳水化合物消化的最后階段起著重要作用，聚類分析也篩選出酒精和小分子代謝條目。差異基因和聚類分析結(jié)果說明經(jīng)過胃和十二指腸后，空腸是碳水化合物的消化末端，具有預(yù)防前端碳水化合物消化不完全的備用酶。聚類分析篩選的10 個(gè)條目中，7 個(gè)與脂代謝有關(guān)。KEGG 分析中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和過氧化物酶體信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)脂類、葡萄糖代謝和炎癥反應(yīng)[6-7]，其余通路也均與脂肪酸代謝有關(guān)，說明空腸中脂肪酸的消化和代謝相對(duì)比較活躍。在差異倍數(shù)較大的基因中，有氨基酸、脂類和維生素類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，5 個(gè)核心基因中有4 個(gè)參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，說明空腸對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都具有更強(qiáng)的吸收作用。聚類分析中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)條目證明了空腸的吸收功能。綜上所述，與盲腸相比，雞的空腸中有少量的碳水化合物消化和比較旺盛的脂類消化，并對(duì)氨基酸、脂肪和維生素等具有更強(qiáng)的吸收作用。

雞盲腸的表達(dá)上調(diào)的DEGs 主要聚集在機(jī)體發(fā)育和細(xì)胞周期，5 個(gè)核心基因均與細(xì)胞周期有關(guān)。這可能與雞盲腸扁桃體的功能密切相關(guān)。盲腸扁桃體是禽類最大的腸相關(guān)性淋巴組織，由彌散性和密集型淋巴組織組成[8]，含T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞，對(duì)腸道病原菌具有局部免疫作用[9-10]。扁桃體相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)比較活躍，細(xì)胞周期基因表達(dá)量則相應(yīng)上調(diào)。KEGG 分析中，黏附斑和ECM-受體互作通路參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖[11-14]等生理作用，與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。硫代謝、半胱氨酸和組氨酸代謝在腸道相關(guān)的研究中報(bào)道較少。半胱氨酸和組氨酸是雞體內(nèi)的含硫氨基酸。生物體內(nèi)的硫有轉(zhuǎn)移基團(tuán)的作用[15]。含硫氨基酸具有抗氧化和清理腸道內(nèi)自由基等作用，還是蛋白質(zhì)生物活性的關(guān)鍵氨基酸[16-17]。盲腸內(nèi)硫代謝和含硫氨基酸相關(guān)基因的高表達(dá)可能與抗體生成、抗生素合成和腸道自由基的清除有關(guān)。此外，由于盲腸中存在豐富的腸道微生物，抗生素的合成也是必不可少。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，盲腸主要吸收粗纖維分解的脂肪酸和細(xì)菌合成的維生素，本研究中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)DEGs?？赡苁桥c空腸相比，盲腸中的脂肪酸和維生素吸收只是少量，盲腸中相關(guān)基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于空腸。

在差異倍數(shù)較大的DEGs 中，空腸中高表達(dá)的ACE2和盲腸中高表達(dá)的CBS具有廣泛的生物學(xué)功能。ACE2編碼蛋白的羧肽酶結(jié)構(gòu)域不僅能有效切割血管緊張素（Ang）ΙΙ 的C 末端苯丙氨酸，產(chǎn)生血管擴(kuò)張劑Ang 1-7，還通過切割A(yù)ng Ι 的C 末端亮氨酸生成Ang 1-9，并進(jìn)一步加工為Ang 1-7[18-19]，抵消血管緊張素的作用，舒張血管，增加血流量?？漳c中ACE2的高表達(dá)能夠擴(kuò)張消化道血管系統(tǒng)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。此外，ACE2能協(xié)助將中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SL6A19 轉(zhuǎn)運(yùn)至腸上皮細(xì)胞的質(zhì)膜，促進(jìn)腸道中性氨基酸的運(yùn)輸[19-20]。這與空腸功能也是相符的。CBS催化同型半胱氨酸（Hcy）與絲氨酸的縮合形成胱硫醚[16]，這是轉(zhuǎn)硫途徑中的起始步驟和限速步驟[21-22]。CBS缺乏會(huì)導(dǎo)致同型半胱氨酸尿癥[23]。胱硫醚隨后被胱硫醚γ-裂解酶（CTH）裂解形成半胱氨酸，后者為谷胱甘肽的前體[17]。此外，CBS還參與了內(nèi)源性硫化氫（H2S）生成[24]。CBS通過控制Hcy 和H2S 代謝發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括氧化還原穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)修飾等[17,22]。本研究發(fā)現(xiàn)盲腸中高表達(dá)CBS可能會(huì)參與抗體等蛋白的修飾，并在維持腸道的氧化還原方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究篩選了空腸和盲腸中的差異表達(dá)基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從分子角度探討空腸和盲腸的生理功能，發(fā)現(xiàn)空腸中脂肪消化比較旺盛，碳水化合物的消化相對(duì)較弱，且蛋白質(zhì)、維生素和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用較強(qiáng)；盲腸與腸道的局部免疫有關(guān)，可維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。