民豬和大白豬背最長(zhǎng)肌中肌紅蛋白基因的表達(dá)量差異

李忠秋，劉春龍，吳賽輝，張冬杰，孫金艷，彭福剛，何鑫淼，馬 紅，劉 娣*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150086；2.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑土生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150081）

豬肉顏色是消費(fèi)者判斷肉品品質(zhì)最直接最簡(jiǎn)單的方法，也是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)意愿的直接因素，顏色鮮紅的豬肉一般被消費(fèi)者認(rèn)為品質(zhì)較好[1-2]。肉色的主要呈色物質(zhì)是肌肉中的肌紅蛋白（Myoglobin）、血紅蛋白（Hemoglobin）和細(xì)胞色素C3（Cytochrome C3）3 種物質(zhì)。血紅蛋白在豬只屠宰放血的過(guò)程中大量流失，對(duì)于肉色的貢獻(xiàn)視放血程度和肌肉部位不同而定，占6%～16%[3]；細(xì)胞色素C3 對(duì)肉色的貢獻(xiàn)率較小[4]；而肌紅蛋白對(duì)充分放血的肉色的貢獻(xiàn)率為80%～90%，肌紅蛋白對(duì)肉色起決定作用[3,5-6]。

民豬是我國(guó)東北地區(qū)一個(gè)古老的地方豬種，具有繁殖性能高、抗寒抗病能力強(qiáng)、體質(zhì)強(qiáng)健和肉品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)。民豬的肉色鮮紅、大理石花紋均勻、肌內(nèi)脂肪含量高、口感細(xì)膩多汁、肉味香醇和無(wú)PSE 肉發(fā)生等[7-10]。研究表明民豬肉色評(píng)分顯著高于大白豬[7]，而民豬與大白豬肌紅蛋白基因表達(dá)差異報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)在采用Lab 法測(cè)定民豬和大白豬肉色差異的基礎(chǔ)上，采用Realtime-PCR 法研究民豬和大白豬背最長(zhǎng)肌中肌紅蛋白基因mRΝA 表達(dá)差異，從分子水平分析民豬和大白豬肉色差異的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖基地選取民豬（體重95kg）、民豬（160 d）和大白豬（體重95 kg，160 d）各6 頭，共計(jì)18 頭。試驗(yàn)日糧配方參照《瘦肉型豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（GB 8471-87）豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制而成。屠宰前，禁食24 h，不禁水，嚴(yán)禁鞭打、急趕、過(guò)度擁擠等刺激。屠宰后迅速取第13和14 肋間背最長(zhǎng)肌肌肉樣品1 g 左右，放入凍存管中，投入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存，用于檢測(cè)肌紅蛋白基因表達(dá)。取背最長(zhǎng)肌于4℃冷庫(kù)內(nèi)排酸24 h，取胸腰椎連接部背最長(zhǎng)肌鮮肉樣進(jìn)行肉色檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉色測(cè)定 測(cè)定胸腰椎連接部背最長(zhǎng)肌。將色差計(jì)設(shè)置為D65 光源，波長(zhǎng)400～700 nm。取排酸24 h 的胸腰椎連接部背最長(zhǎng)肌，垂直肌肉走向取1 cm 厚肉片，用保鮮膜覆蓋肉片新鮮切面，放入4℃冰箱，氧合30 min，取下保鮮膜，用儀器選擇肉色均勻部分測(cè)量10 次，然后計(jì)算平均值。肉色指標(biāo)包括亮度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）。

1.2.2 總RΝA 的提取和cDΝA 合成按照Tri Pure RΝA Ιsolation Reagent 試劑盒說(shuō)明提取肌肉樣品的總RΝA，提取總RΝA 完整性的鑒定方法為瓊脂糖凝膠電泳，總RΝA 濃度的測(cè)定方法為分光光度計(jì)測(cè)定OD值，通過(guò)公式計(jì)算并調(diào)整總RΝA 濃度為1 μg/μL，儲(chǔ)存于-80℃冰箱待用。

cDΝA 合成嚴(yán)格按照Easy-Script One-Step g DΝA Removal and cDΝA Synthesis Snper Mix 試劑盒的要求進(jìn)行。20 μL 反應(yīng)體系：6 μL RΝA，1 μL Oligo dT Primer，4 μL Random Primer，4 μL 5×PrimeScript Buffer，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ι，4 μL Rnase free H2O。反應(yīng)步驟為37℃ 15 min，85℃ 5 s，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)ΝCBΙ 上提交的豬肌紅蛋白序列設(shè)計(jì)熒光定量引物，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 肌紅蛋白和GAPDH 的引物序列

1.2.4 熒光定量PCR 檢測(cè) 熒光定量PCR 反應(yīng)體系：2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，0.2μmol/L 的 上、下 游引物各0.5 μL，cDΝA 產(chǎn)物0.5 μL，去離子水8.5 μL，總體積20 μL。熒光定量反應(yīng)在Roche Light Cylcer480 ΙΙ 儀器上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣品3 個(gè)重復(fù)。以GAPDH基因進(jìn)行校正，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法來(lái)計(jì)算。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)中計(jì)算獲得的數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 同體重和同日齡民豬與大白豬的肉色分析 由表2 可見(jiàn)，同體重、同日齡民豬肉色a*值均高于大白豬（P＜0.05），b*值和L*值與大白豬差異不顯著。

表2 同體重民豬和大白豬的肉色分析

2.2 同體重和同日齡民豬與大白豬肌紅蛋白基因表達(dá)差異 由圖1 和圖2 可見(jiàn)，同體重、同日齡民豬肌紅蛋白基因相對(duì)表達(dá)量均高于大白豬（P＜0.05）。

圖1 同體重民豬和大白豬肌紅蛋白基因表達(dá)情況

圖2 同日齡民豬和大白豬肌紅蛋白基因表達(dá)情況

3 討論

肉色是評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)的一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，它直接影響消費(fèi)者對(duì)豬肉的購(gòu)買(mǎi)意愿和行為。大多數(shù)消費(fèi)者認(rèn)為鮮紅的肉色是豬肉新鮮程度的表現(xiàn)，肉色若有變化則認(rèn)為豬肉品質(zhì)較差或已經(jīng)腐敗變質(zhì)，消費(fèi)者就不會(huì)有購(gòu)買(mǎi)的欲望，經(jīng)營(yíng)者就會(huì)打折銷(xiāo)售或丟棄。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)因?yàn)槿忸?lèi)變色問(wèn)題每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10 億美元[11]。Lab 系統(tǒng)是測(cè)定和表示肉色比較客觀和準(zhǔn)確的方法，a*值表示紅色度，是體現(xiàn)肉色的一個(gè)重要的指標(biāo)。肉色評(píng)分與肉色a*值顯著正相關(guān)，民豬肉色評(píng)分顯著高于比大白豬[7]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示民豬肉色a*值顯著高于大白豬，從另一方面表明民豬肉色好于大白豬。肌紅蛋白是豬肉呈色的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量直接影響肉色的深淺[12]。肌紅蛋白是脊椎動(dòng)物肌肉中的血紅素蛋白，主要以高濃度存在于骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的胞漿中，通過(guò)對(duì)不同品種豬背最長(zhǎng)肌肌紅蛋白含量和遺傳參數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，肌紅蛋白含量為中等遺傳力，遺傳力估計(jì)值為0.27[13]。肌紅蛋白含量是新鮮豬肉顏色的決定因素[14]，肌紅蛋白基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，mRΝA 表達(dá)量與肌紅蛋白濃度呈顯著正相關(guān)[15]，肉色a*值與肌紅蛋白mRΝA 表達(dá)量顯著相關(guān)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)首次研究了民豬與大白豬背最長(zhǎng)肌中肌紅蛋白基因mRΝA 表達(dá)差異，從分子水平分析民豬與大白豬肉色差異的內(nèi)在機(jī)制，結(jié)果顯示民豬背最長(zhǎng)肌肌紅蛋白基因mRΝA 表達(dá)量均顯著高于大白豬，進(jìn)一步在分子水平上顯示民豬肉色好于大白豬。民豬與大白豬的肌紅蛋白含量表達(dá)的差異是否與兩個(gè)品種某些部位的核苷酸序列的差異有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肌紅蛋白含量對(duì)肉色有顯著影響，民豬肌紅蛋白表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)白豬，這是民豬的肉色好于長(zhǎng)白豬的內(nèi)在原因。