SEMA4D與頭頸部鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的生物信息學(xué)研究

石鳳，王俊利，董明右，龐曉霞，李蘭，李光景，楊鳳蓮

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 百色 533000)

頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，包括口腔腫瘤、口咽腫瘤、喉部腫瘤和鼻咽癌，每年約有700 000新增病例數(shù)[1]。HNSCC的早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已進展為中晚期，常累及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HNSCC的預(yù)后較差，晚期治療的常規(guī)手段包括手術(shù)、放化療等[2]，對患者的身心健康產(chǎn)生很大的影響。軸突導(dǎo)向蛋白4D(semaphorin 4D，SEMA4D)屬于信號素家族成員第Ⅳ類，是一種跨膜糖蛋白，大小為150 kDa。SEMA4D包含SEMA結(jié)構(gòu)域，半胱氨酸富集區(qū)、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和氨基酸末端信號結(jié)構(gòu)域。SEMA4D存在兩個受體CD72和PlexinBi，配體與受體相結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、免疫細胞的活化、腫瘤新生血管的形成及促進腫瘤的生長、侵襲和遷移能力[3]。近年來，越來越多的研究表明SEMA4D在前列腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中高表達[4]。Zhang C等[5]研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D通過促進HNSCC的上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，進而促進HNSCC的轉(zhuǎn)移。HNSCC是一種復(fù)雜的頭頸部腫瘤，然而，SEMA4D在HNSCC中的相關(guān)性研究較少且其具體作用機制仍需進一步闡明，因此，本研究將通過來自于腫瘤基因組圖譜(The cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫進行分析SEMA4D在泛癌中的表達、SEMA4D與HNSCC的免疫細胞浸潤情況以及對HNSCC患者的生存期進行相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 從UCSC Xena官網(wǎng)(https://xena.ucsc.edu/)提取HNSCC等33個腫瘤的GDC TCGA數(shù)據(jù)。所有的研究數(shù)據(jù)來源于TCGA公共數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對外開放，因此，不需要相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 SEMA4D與HNSCC臨床特性的相關(guān)性 通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在線數(shù)據(jù)庫分析SEMA4D表達水平與HNSCC患者的腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV16感染情況的相關(guān)性。

1.3 SEMA4D與HNSCC免疫浸潤細胞的相關(guān)性 輸入癌癥的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過R語言3.6.0的“estimate”包對HNSCC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行免疫細胞得分，分析SEMA4D與HNSCC患者的免疫細胞得分及免疫浸潤細胞[CD4+T細胞、CD8+T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)、自然殺傷細胞、中性粒細胞和巨噬細胞]的相關(guān)性。

1.4 Kaplan-Meier法分析HNSCC患者的生存分析 通過SEMA4D表達水平的中位值將HNSCC患者分為兩組，分別為高表達SEMA4D組和低表達SEMA4D組。采用Kaplan-Meier分析SEMA4D表達水平與HNSCC患者總體生存期(患者從確診為HNSCC開始至患者因任何原因?qū)е滤劳龅臅r間)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 通過Perl軟件對TCGA來源的腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因編號轉(zhuǎn)化，通過Wilcoxon檢驗分析SEMA4D表達水平與HNSCC患者的腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV16感染是否有關(guān)；通過Spearman相關(guān)性檢驗計算SEMA4D表達水平與HNSCC免疫細胞得分和免疫浸潤細胞的相關(guān)性；通過Kaplan-Meier法分析SEMA4D表達水平與HNSCC患者總體生存期是否有關(guān)，本研究檢驗結(jié)果均通過R語言3.6.0軟件分析計算所得。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEMA4D在腫瘤組織中的表達 將下載的GDC TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過Perl命令提取所需要的輸入文件，包括基因名稱、SEMA4D在腫瘤組織中的表達水平、組織類型和腫瘤類型。通過R語言3.6.0 “ggpubr”包對SEMA4D在腫瘤組織和正常組織中的表達繪制箱線圖，結(jié)果如圖1所示，SEMA4D在HNSCC中的表達水平相對于正常組織降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

注：藍色：SEMA4D在正常組織中的表達量；紅色：SEMA4D在腫瘤組織中的表達量。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。圖1 SEMA4D在腫瘤組織中的表達

2.2 SEMA4D與HNSCC臨床特征的分層分析 以上結(jié)果顯示，SEMA4D在HNSCC中的表達相對于正常組織顯著降低，為了進一步探討SEMA4D在HNSCC亞組中的相對表達信息，本研究通過UALCAN在線網(wǎng)站對SEMA4D表達水平與HNSCC臨床特征的相關(guān)性進行分層分析。研究結(jié)果顯示：SEMA4D在腫瘤分級Ⅰ級中的表達水平相對于正常組顯著降低(P=0.005)，而在腫瘤分級Ⅳ中的表達水平相對于正常組顯著升高(P=0.003)。由于腫瘤分級Ⅳ的樣本量僅為7例，因此，平均表達水平升高具有偏倚性(見圖2A)。此外，SEMA4D在HPV16感染患者中的表達水平升高，而在HPV16陰性患者中的表達水平降低。然而，SEMA4D與HNSCC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，見圖2B、圖2C。

注：A：SEMA4D與HNSCC患者腫瘤分級的相關(guān)性分析；B：SEMA4D與HNSCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；C：SEMA4D與HNSCC患者HPV16感染狀態(tài)的相關(guān)性分析。圖2 SEMA4D在HNSCC亞組中的表達水平

2.3 SEMA4D與HNSCC的TMB和MSI 腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)是多種腫瘤的有效預(yù)后標(biāo)志物和免疫治療反應(yīng)指標(biāo)。通過分析基因在腫瘤中與TMB和MSI的相關(guān)性，以探討基因活性與腫瘤突變的關(guān)系。通過Spearman對SEMA4D與HNSCC進行TMB和MSI分析，研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D與HNSCC的TMB和MSI不具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明SEMA4D與HNSCC突變可能不具有相關(guān)性，見圖3。

注：A：TMB；B：MSI。圖3 SEMA4D與泛癌TMB和MSI的相關(guān)性

2.4 SEMA4D與免疫細胞浸潤 通過R語言3.6.0 “estimate”包計算HNSCC的免疫細胞得分，分析其與SEMA4D表達水平的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)：SEMA4D表達水平與HNSCC免疫細胞得分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.37，見圖4。進一步通過R語言3.6.0的Spearman相關(guān)性檢驗對SEMA4D表達水平與HNSCC免疫浸潤細胞進行分析。研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D表達水平與CD4+T細胞、CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞呈正相關(guān)，而與自然殺傷細胞、中性粒細胞和巨噬細胞呈負相關(guān)，見圖5。

圖4 SEMA4D與HNSCC免疫細胞得分的相關(guān)性

注：A：CD4+T細胞；B：CD8+T細胞；C：調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)；D：自然殺傷細胞；E：中性粒細胞；F：巨噬細胞。圖5 SEMA4D與免疫浸潤細胞的相關(guān)性

2.5 SEMA4D與HNSCC患者生存期的相關(guān)性分析 將SEMA4D在不同腫瘤中的表達水平根據(jù)均值分為兩組，分別為SEMA4D高表達組和SEMA4D低表達組，采用Kaplan-Meier分析SEMA4D表達水平與HNSCC患者總體生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示：SEMA4D高表達增加HNSCC患者的總體生存期(P=0.013)，見圖6。

圖6 SEMA4D與HNSCC的總體生存期相關(guān)性

3 討論

SEMA4D，也被稱之為CD100，是信號素超家族的SEMA成員，最初發(fā)現(xiàn)于免疫細胞。SEMA4D在靜息T細胞中高表達，在靜息B細胞和抗原提呈細胞中低表達。研究發(fā)現(xiàn)，SEMA4D通過與受體CD72結(jié)合，參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程，促進B細胞和抗原提呈細胞的激活和成熟，抑制單核細胞的遷移能力。然而，SEMA4D與受體Plexin-B1結(jié)合，參與神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞，促進腫瘤新生血管的形成，為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，進而促進腫瘤細胞的生長、侵襲和遷移[6]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在血管形成的生理和病理狀態(tài)下都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，促進血管內(nèi)皮細胞的生長和增殖，抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡，維持血管的滲透脆性。Chen Y等[7]研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D與VEGF表達水平呈正相關(guān)，并協(xié)同促進卵巢癌的血管形成。HNSCC排列腫瘤第六位，由于其腫瘤位置隱蔽，發(fā)病初期不易察覺，轉(zhuǎn)移性高等特點，使HNSCC患者的生存率不超過50%[8]。既往研究表明[5]，上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，CD100-Plexin-B1通過激活Vav1-rac1/RhoAPAK1通路促進HNSCC上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。另一項研究發(fā)現(xiàn)[9]，SEMA4D調(diào)節(jié)成骨細胞中核因子κβ配體(RANKL)受體，與胰島素樣生長因子-I(IGF-I)正向調(diào)節(jié)，促進HNSCC腫瘤的破骨形成和骨轉(zhuǎn)移。然而，SEMA4D作為一種免疫相關(guān)因子，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，SEMA4D是否通過促進腫瘤免疫逃逸進而導(dǎo)致HNSCC的發(fā)生，以及SEMA4D與HNSCC患者的預(yù)后仍需進一步闡明。

本研究通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D在膀胱移行細胞癌(BRCA)、宮頸癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸癌(COAD)、肺腺癌(LUAD)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)等腫瘤中高表達，然而在膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)、腎細胞癌(KICH)、腎透明細胞癌(KIRC)和甲狀腺癌(THCA)中低表達。該研究結(jié)果與Zhang C等[5]和Takada H等[9]的研究結(jié)論相反。通過UALCAN在線數(shù)據(jù)庫進一步分析SEMA4D與HNSCC患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV16感染情況的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D表達水平與腫瘤分級呈負相關(guān)，并且降低HPV16陰性HNSCC患者中的表達水平，而與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不具有相關(guān)性。在發(fā)達國家，HNSCC的發(fā)病率逐漸下降，然而，由HPV感染的HNSCC患者逐漸增加，主要類型為HPV16(70.7%)，其感染后的機體清除率最低[10]。TMB和MSI有效地反映了腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療指標(biāo)，提示基因活性與腫瘤突變相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)SEMA4D與HNSCC的TMB和MSI有關(guān)。SEMA4D作為一種免疫相關(guān)性細胞因子，來源于免疫細胞，參與免疫細胞的激活和活化，通過分析SEMA4D與免疫細胞得分和腫瘤免疫浸潤細胞的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D與HNSCC的免疫細胞得分呈正相關(guān)。并與CD4+T細胞、CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞呈正相關(guān)，而與自然殺傷細胞、中性粒細胞和巨噬細胞呈負相關(guān)。CD8+Treg細胞和CD4+Treg細胞參與機體免疫抑制能力，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)、免疫耐受和抗抑制免疫排斥反應(yīng)。然而，在腫瘤中，研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T/Treg細胞比例更有效判斷機體免疫抑制能力，其比例增加促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，進而引起腫瘤的發(fā)生[11-12]。因此，SEMA4D在HNSCC中的作用機制，是否與CD8+Treg細胞和CD4+Treg細胞有關(guān)，仍需深入闡明。進一步對SEM4D與HNSCC的生存期進行分析，研究結(jié)果顯示，SEMA4D高表達患者的總體生存期較好。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SEMA4D在HNSCC患者和腫瘤分級為Ⅰ級患者中的表達水平顯著降低，并與免疫細胞得分和腫瘤免疫浸潤細胞相關(guān)，其表達水平越低，預(yù)后越差。該生物信息學(xué)研究表明SEMA4D在HNSCC中為保護基因，與其他研究結(jié)論存在差異?？赡艽嬖谝韵聨c因素：第一，該研究群體均來自于TCGA數(shù)據(jù)庫，可能存在基因種族人群差異，造成研究結(jié)論不一致。第二，該研究人群來源區(qū)域未知，可能存在樣本選擇偏倚以及環(huán)境因素影響。本文初步探討SEMA4D在HNSCC免疫浸潤細胞的相關(guān)性，SEMA4D是否直接影響CD8+Treg細胞和CD4+Treg細胞的表達水平，仍需進一步深入研究。