分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中的地西泮

曾軍杰 陳思 張小軍 嚴忠雍

摘要 [目的]建立一種測定水產(chǎn)品地西泮農(nóng)藥殘留的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。[方法]樣品先后經(jīng)1%氨水-乙腈和1%乙酸-乙腈進行提取，PSA∶C18∶無水MgSO4=1∶0.5∶3為吸附劑進行分散固相萃取凈化，C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離，0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨∶甲醇（90∶10）為初始流動相，結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）進行定量分析。[結(jié)果]添加樣品的回收率為92.5%～95.4%，相對標準偏差（RSD）為5.2%～7.3%，檢出限為1.0 μg/kg。[結(jié)論]該方法靈敏度、精密度、回收率均能滿足水產(chǎn)品中地西泮的快速分析測定。

關(guān)鍵詞 水產(chǎn)品;分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;地西泮;農(nóng)藥殘留

中圖分類號 TS-254.7? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）12-0198-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.052

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Determination of Diazepam in Aquatic Products by Dispersive Solid Phase Extraction Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

ZENG Jun jie1，2，CHEN Si1，ZHANG Xiao jun1 et al （1.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang，Zhoushan，Zhejiang 316021;2.Marine and Fishery Institute，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract [Objective]A method for the determination of diazepam pesticide residues in aquatic products by dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established.[Method]The samples were successively extracted by 1% ammonia water acetonitrile and 1% acetic acid acetonitrile，and purified by dispersive solid phase extraction with PSA∶C18∶anhydrous MgSO4=1∶0.5∶3 as adsorbent，C18 column （2.1 mm×100 mm，1.7 μ m） separation，0.1% formic acid 5 mmol/L ammonium acetate：methanol （90∶10） as the initial mobile phase，combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC MS/MS） for quantitative analysis.[Result]The recoveries of the added samples were 92.5%-95.4%，and the relative standard deviations （RSD） were 5.2%-7.3%.The detection limit was 1.0 μg/kg.[Conclusion]The sensitivity，precision and recovery rate of this method can meet the requirements of rapid analysis and determination of diazepam in aquatic products.

Key words Aquatic products;Dispersive solid phase extraction ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Diazepam;Pesticide residues

地西泮，又名安定，是苯二氮卓類藥物（ BDZ） ，為第二代催眠藥[1]。在臨床上主要用于治療失眠[2]，但患者長期服用[3]，會出現(xiàn)依賴性和耐藥性，停藥后又易出現(xiàn)易怒、情緒激動、幻聽等癥狀[4]，導(dǎo)致失眠加重[5-7]。在家禽家畜養(yǎng)殖業(yè)中使用這類藥物的現(xiàn)象時有發(fā)生，通常養(yǎng)殖者用藥來促進家禽家畜生長，達到增肥的目的[8]，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中較少投入使用。近年來，不少水產(chǎn)養(yǎng)殖者和商販為了達到提高水產(chǎn)品成活率目的[9-12]，在養(yǎng)殖和運輸環(huán)節(jié)中頻繁使用地西泮來放緩魚類的新陳代謝，減輕魚體的環(huán)境壓力。我國農(nóng)業(yè)部235號公告已明確規(guī)定在動物性食品中不得檢出地西泮;農(nóng)業(yè)部176號公告也規(guī)定嚴禁在飼料和動物飲用水中使用地西泮等精神類藥物。據(jù)相關(guān)報道，近年來全國已有多個省份水產(chǎn)品中地西泮殘留檢出的事件發(fā)生[13]。2020年，筆者在一次魚類藥物殘留大排查中發(fā)現(xiàn)，多例水產(chǎn)品含有地西泮，并且檢出水平較高，這必將給居民的水產(chǎn)品消費安全帶來巨大的隱患。

目前地西泮的檢測方法較多，主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）[14-17]、高效液相色譜法（HPLC）[18-19]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[20-22]等，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）擁有超高效液相快速、有效的分離能力和串聯(lián)質(zhì)譜的精準靈敏度，是一種快速發(fā)展的分析技術(shù)[23]。將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與分散固相萃取技術(shù)相結(jié)合[24]是目前比較流行的檢測方式，兼具兩者的優(yōu)點，可以真正實現(xiàn)多種獸藥殘留的快速檢測。該研究使用分散固相萃取技術(shù)進行前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為檢測方法，實現(xiàn)了地西泮殘留的快速檢測，為分散固相萃取前處理方式在水產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用提供更強的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地西泮（DXP）、氘代地西泮（DXP-D5），純度均>98%， 美國Sigma公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨，色譜純，德國Merck公司;MgSO4（分析純）、氨水（分析純）、PSA（粒徑40～60 μm）、C18（粒徑50 μm），上海國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM 超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），美國Waters公司; 3-30K 高速冷凍離心機，Sigma公司;MX-S 渦旋攪拌器，美國Scilogex公司;N-EVAP-112氮吹儀，美國Organomation公司。

1.3 溶液的制備

1.3.1 吸附劑的制備。取PSA、C18、MgSO4適量，按照1∶0.5∶3的比例混勻，放入烘箱烘干，備用。

1.3.2 標準曲線溶液的制備。分別準確稱取1 mg地西泮和氘代地西泮固體標準物質(zhì)，用甲醇溶解定容至100 mL，配成10 μg/mL的中間使用液，于-18 ℃下避光保存。中間使用液再次稀釋，配制成100 ng/mL使用液，4 ℃避光備用。

1.4? UPLC-MS條件

1.4.1 色譜條件。ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;柱溫40? ℃;樣品室溫度10 ℃;進樣量1.0 μL;流動相為0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液（A）、甲醇（B）;流速0.3? mL/min;洗脫條件：0～0.5 min，10% B;0.5～2.5 min，30% B;2.5～5.0 min，95% B;5.0～7.5 min，95% B;7.5～1.0 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI+）;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;毛細管電壓3.2 kV;錐孔電壓38 V;脫溶劑氣溫度380? ℃;離子源溫度120? ℃;碰撞池壓力0.003 hPa;錐孔氣流量 50 L/h;干燥氣體流速600 L/h。地西泮及其氘代物的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取。

稱取樣品1 g于15? mL離心管中，準確加入50 μL混合內(nèi)標使用液，渦旋30 s。加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液、2.5 g 氯化鈉，渦旋提取1 min，超聲提取10 min，以6 000 r/min 離心5 min。收集上清液。剩余混合物中再加入5 mL 1%氨水-乙腈溶液，重復(fù)提取1次，合并2次上清液，待凈化。

1.5.2 凈化。將吸附劑加入“1.5.1”提取液中，旋緊螺旋蓋，高速渦旋1 min，6 000 r/min離心5 min。

1.5.3 濃縮、轉(zhuǎn)溶。

合并所有有機相溶液，于40 ℃下氮氣吹至干。準確加入1.0 mL 10%甲醇溶液溶解殘渣，渦旋混合1 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以20 μL/min的流速將標準溶液打入離子源，在正離子模式下進行掃描，對毛細管電壓和錐孔電壓進行優(yōu)化，確定地西泮的毛細管電壓、錐孔電壓分別為3.2 kV和38 V。用二級質(zhì)譜將母離子擊碎，選取經(jīng)碰撞后響應(yīng)值較高的2個子離子分別為定量離子和定性離子，并進行優(yōu)化，如圖1所示。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

該試驗以C18色譜柱作為色譜分析柱，分別選擇乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈體系以及0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇體系作為流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、甲醇-水均能完全出峰，但甲醇作為有機相時峰形比乙腈好，響應(yīng)值高，同時在水相中加入0.1%甲酸和5 mmol乙酸銨，改善了被待測物質(zhì)的峰形，這是由于有機酸和揮發(fā)性鹽提高了他們的分離度和離子化效率，圖2～3為待測物質(zhì)的色譜圖。

2.3 前處理優(yōu)化

2.3.1 提取條件的優(yōu)化。

地西泮極性偏弱，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶劑，不溶于水。該試驗選取1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈、乙酸乙酯和甲醇4種提取溶劑進行比較，4種溶劑提取效率如圖4所示。

試驗表明甲醇提取，地西泮回收率較好（93.9%），但部分油脂被萃取到提取液中，對儀器（UPLC-MS/MS）響應(yīng)值有明顯的抑制作用。1%氨水乙腈提取地西泮回收率91.7%，故選擇乙腈超聲10 min，提取2次保證提取率的最大化。

2.3.2 凈化條件的選擇。

目前，在對地西泮報道的已有文獻中，多以HLB、C18等SPE凈化柱為主，該試驗以分散固相萃取為前處理方式，對MgSO4、HLB、PSA、C18以及吸附劑進行對比，凈化效果見圖5。結(jié)果表明弱陽離子（HLB、C18）等SPE柱凈化回收率一般，回收率無法滿足水產(chǎn)品檢測的需求;MgSO4、PSA能夠去除樣品中的脂肪酸、糖類物質(zhì)等不同雜質(zhì)，平均回收率高于SPE的方法，并且凈化效果明顯，但回收率過低，也無法滿足水產(chǎn)品的檢測需求;混合吸附劑在除去大部分雜質(zhì)的同時，回收率達到93.2%，符合水產(chǎn)品檢測回收率70%～120%的要求，故選用混合吸附劑。

2.3.3 吸附劑使用量的優(yōu)化。

分別將0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g 的PSA用于凈化試驗，比較PSA不同使用量的凈化效果，結(jié)果如圖6所示。試驗表明，當PSA用量為0.2～0.8 g時，目標物質(zhì)回收率在92%～95%，回收率均比較理想，但是考慮到伴隨著使用量增加，雜質(zhì)去除效率更好，因此選用使用量最大的。當使用量在逐漸增加，回收率明顯降低，此時吸附劑足夠吸附雜質(zhì)，分析原因可能是吸附劑中PSA成分中氨基游離出來，與目標物質(zhì)中某些基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。綜上所述，選擇PSA的使用量為0.8 g，既保證了凈化后樣品的純凈，又保證試驗回收率滿足試驗方法。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 檢出限、定量限及線性關(guān)系。

取草魚空白樣品，按照“1.5”的前處理方法，得到空白基質(zhì)溶液，配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的空白基質(zhì)混合標準工作曲線，以待測物質(zhì)的峰面積（y）和相應(yīng)的濃度（x）繪制標準曲線，得出線性回歸方程為y=0.659 359x-0.042 260 9（r=0.997），表明地西泮濃度在0.5～50.0 μg/L與峰面積的線性關(guān)系良好。根據(jù)7個空白樣品的基線噪音求其平均值，按3倍信噪比計算其方法檢測限（LOD），10倍信噪比計算其方法定量限（LOQ），該化合物檢出限和定量限分別為0.5和1.0 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度。

通過加標回收試驗來評價方法的準確性、精密度和回收率，標準曲線見圖7。在前處理前，將混合標準溶液加至1 g草魚基質(zhì)中，然后按照“1.5”方法進行前處理。其中，混合標準工作液分為1.0、2.0、5.0 ng/mL這3個水平，每個平行測定3次。從表2可以看出，平均回收率為92.5%～95.4%，相對標準偏差（RSD）為5.2%～7.3%，表明該方法重現(xiàn)性強、準確性高、回收率高，能夠滿足日常檢測的要求。

2.5 實際樣品檢測

利用已建立的方法進行草魚體內(nèi)地西泮殘留量的測定。試驗表明，在一次魚類藥物殘留大排查中，200個抽查樣品中有7個草魚樣品檢出地西泮，最高的殘留量為20.7 μg/kg，該研究方法能夠準確測定水產(chǎn)品中地西泮殘留量。

3 結(jié)論

該研究采用分散固相萃取技術(shù)，通過對質(zhì)譜、色譜、提取溶劑、凈化條件的優(yōu)化，結(jié)合UPLC-MS/MS 技術(shù)，建立了水產(chǎn)品中地西泮快速定量分析方法。分散固相萃取能夠降低樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。通過質(zhì)譜的全掃描模式下的精確質(zhì)量母離子作為定量離子，更適合樣品中目標化合物的快速篩查。經(jīng)實際樣品檢測確證，該方法快速、準確、靈敏，滿足水產(chǎn)品中地西泮的檢測分析。

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