馬鈴薯PLRV病毒寧夏分離物外殼蛋白基因CP的克隆與序列分析

陳曉軍 郭成瑾 王喜剛 沈瑞清

摘要 利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法分離得到了PLRV寧夏分離物，并采用RT-PCR技術(shù)分離得到了寧夏分離物外殼蛋白基因CP的核苷酸序列，PLRV CP基因共624 bp，推測(cè)編碼208個(gè)氨基酸殘基，分子量大小為23 234.2，等電點(diǎn)11.85。通過同源性分析，其與2013年內(nèi)蒙古分離物（KC456052）最為接近，同源性達(dá)99.8%;進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其有一定的地理區(qū)域性，為單獨(dú)分支起源。

關(guān)鍵詞 馬鈴薯卷葉病病毒;反轉(zhuǎn)錄;寧夏PLRV分離物

中圖分類號(hào) S-435.32;S-432.4? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）11-0096-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Molecular Biological Identification of Potato Leafroll Virus from Field Samples in Ningxia Province

CHEN Xiao-jun1， GUO Cheng-jin2， WANG Xi-gang2 et al

（1.Agricultural Biotechnology Center， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Lab of Agricultural Biotechnology of Ningxia， Yinchuan， Ningxia 750002;2.Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences /Key Laboratory of Plant Disease and Pest Control， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract PLRV CP gene was isolated from Ningxia by DAS-ELISA method. The nucleotide sequence of CP gene of PLRV isolated from Ningxia was obtained by RT-PCR. The total length of PLRV CP gene was 624 bp. It was inferred that PLRV CP gene encoded 208 amino acid residues with molecular weight of 23 234.2 and pI of 11.85. Through homology analysis， it was the closest to the isolate （KC456052） from Inner Mongolia in 2013， with 99.8% homology;phylogenetic tree analysis showed that it had a certain geographical region， which was a single branch origin.

Key words PLRV;RT-PCR;Ningxia isolate

馬鈴薯卷葉病毒（potato leafroll virus，PLRV）是導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)的病毒病，通過蚜蟲傳播，也通過感染病毒的塊莖傳播，造成30%～80%的產(chǎn)量損失[1]。馬鈴薯作為寧夏南部山區(qū)重要的糧食、蔬菜兼用的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積達(dá)109 927 hm2[2]。馬鈴薯病毒病時(shí)常蔓延，其中PLRV導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量和質(zhì)量大幅下降。我國(guó)已對(duì)內(nèi)蒙古、青海、甘肅、廣東、河北等省區(qū)的PLRV分離物進(jìn)行同源性分析，然而寧夏仍缺乏該病毒分離物的序列分析。為此，筆者利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法分離得到了PLRV寧夏分離物，并采用RT-PCR技術(shù)分離得到了寧夏分離物外殼蛋白基因CP的序列，為該病毒病的防治和流行病學(xué)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。

馬鈴薯PLRV病毒ELISA試劑盒購(gòu)于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，RNA提取試盒為SV Total RNA Isolation System（promega）;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為mProm-II Reverse Transcriptase（promega）、離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）;T連接載體試劑盒為北京全式金生物技術(shù)公司的pEasy-Blunt Simple Coning Kit，Pfu DNA聚合酶與DNA分子量marker為天根生物技術(shù)公司產(chǎn)品;引物由北京奧科鼎盛公司合成;其余試劑均為分析純。

1.1.2 馬鈴薯病毒樣本。

2011年7月，馬鈴薯PLRV病毒樣本在寧夏固原農(nóng)業(yè)推廣總站試驗(yàn)田中獲得，選擇有癥狀的或從植株的頂部、中部和底部各取1片葉子合在一起，帶回實(shí)驗(yàn)室于-70 ℃低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯PLRV病毒的確定。

將馬鈴薯病葉樣品（0.10～0.15 g）放于塑料袋中，用記號(hào)筆標(biāo)記好。向樣品袋中加入1.0～1.5 mL提取緩沖液（樣品重量∶樣品提取緩沖液=1∶10），將樣品充分研磨。將樣品袋中的溶液擠到1.5 mL的離心管中，4 000 r/min離心3 min，取上清液備用。然后按試劑盒說明進(jìn)行雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（DAS-ELISA）測(cè)定。選定陽(yáng)性植株備用。

1.2.2 馬鈴薯總RNA提取。

對(duì)陽(yáng)性材料采用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取總RNA，試驗(yàn)步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行，吸取10 μL用于1%瓊脂糖電泳，余量RNA保存于-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)。

從Genbank中獲得PLRV基因組核苷酸序列（FJ859020.1，F(xiàn)J853192.1，AY307123.1，X13906.1，GU256062.1，F(xiàn)J481109.1），利用BLAST和Clustal軟件進(jìn)行保守性分析，設(shè)計(jì)引物序列：

上游引物PLRV_CPF：5′-ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAATG-3′

下游引物PLRV_CPR：5′-CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCACCCT-3′

引物由北京奧科生物科技有限公司合成。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增。

按Promega 公司mProm-Ⅱ Reverse Transcriptase試劑盒說明進(jìn)行。取2 μg馬鈴薯總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，進(jìn)行總cDNA反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為20 μL，MMLV RT buffer 4 μL，總RNA 2 μL，dNTP 2 μL，反轉(zhuǎn)錄酶MMLV 1 μL，Oligo（dT）16 1 μL，RNA酶抑制劑RNasesin 0.5 μL，DEPC處理的H2O 至20 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置-20 ℃保存?zhèn)溆?。以PLRV_CPF、PLRV_CPR為上下游引物，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴(kuò)增馬鈴薯PLRV病毒CP蛋白基因。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含10×buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1 μL，總cDNA（1 μg/μL）1 μL，ddH2O 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)后，72 ℃最后延伸10 min。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上電泳，電壓為8 V/cm。

1.2.5 目的條帶的回收與T載體克隆。

用DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，連接pEasy-Blunt Simple載體，連接體系：PCR膠回收產(chǎn)物4 μL，載體1 μL;連接15 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在氨芐青霉素的LB平板涂板，過夜培養(yǎng)后挑取10個(gè)克隆分別進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，選取3個(gè)經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的克隆送至英俊生物公司測(cè)序。

1.2.6 馬鈴薯PLRV病毒CP蛋白基因序列分析。

對(duì)編碼馬鈴薯PLRV病毒CP蛋白基因序列采用www.ncbi.nlm.nih.gov中的BLAST軟件和DNAMAN 7.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯總RNA的提取

利用RNA提取試劑盒提取馬鈴薯總RNA電泳結(jié)果見圖1，樣品上樣量為10 μL，1、2道均為馬鈴薯PLRV病毒陽(yáng)性植株。

2.2 RT-PCR結(jié)果

從圖2可見，1、2號(hào)樣品均擴(kuò)增出627 bp的目標(biāo)條帶，與設(shè)計(jì)大小一致。

2.3 馬鈴薯PLRV病毒CP的序列特征

PLRV CP基因共624 bp，推測(cè)編碼208個(gè)氨基酸殘基，分子量大小為23 234.2，等電點(diǎn)11.85，沒有明顯的跨膜蛋白（圖3）。PLRV CP蛋白中的17-PRRRRRQSLRRRANR-31 區(qū) 域 起 到核定位信號(hào) NLS（nucleolar localization signal）的功能，使CP和通讀蛋白（RTP）被翻譯后主要存在于細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)[3]。

2.4 同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用分離得到的寧夏PLRV分離物CP基因序列，結(jié)合NCBI中報(bào)道國(guó)內(nèi)分離得到的PLRV CP序列，通過DNAMAN 7.0軟件分析它們之間的序列同源性，結(jié)果見表1。由表1可知，分離得到的寧夏分離物與2013年內(nèi)蒙古分離物（KC456052）最為接近，同源性達(dá)99.8%;與2009 年內(nèi)蒙古分離物（FJ859027）同源性最遠(yuǎn)，達(dá)98.7%。

PLRV CP進(jìn)化樹由MEGA5軟件分析，利用最大似然統(tǒng)計(jì)模型構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，國(guó)內(nèi)分離物大致可以分為3類：KC456052、FJ859027、KC456053、FJ859019、FJ859023、FJ859017、FJ853190、DQ309064、FJ859024為第1類;FJ853189、KC456054、EF063711為第2類;FJ859014、FJ859015、FJ859018、FJ859021、FJ853193、FJ853191、FJ859020、FJ853192為第3類，寧夏分離物與這3類分離物關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)這類分離與國(guó)內(nèi)這些地區(qū)的起源不同，屬于獨(dú)立的支系。

3 討論

在馬鈴薯脫毒生產(chǎn)中，《馬鈴薯脫毒種薯》（GB 18133，2000）規(guī)定需檢測(cè)的5種病毒分別為PVS、PLRV、PVX、PVY和PSTVd，是在我國(guó)廣大馬鈴薯產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重、發(fā)生普遍的5種病毒。

（1）PLRV屬于馬鈴薯黃癥病毒組，馬鈴薯卷葉病毒為直徑約26 nm的六邊形等軸粒子，主要是由蚜蟲以非持久性方式傳播。初次侵染的植株，其典型癥狀是幼葉褪綠、卷曲，一些品種可能產(chǎn)生紅暈，尤其是小葉邊緣。繼發(fā)性侵染的植株通常矮化，卷曲的葉片表現(xiàn)為直立、干燥和革質(zhì)化[1，4]。

（2）目前，對(duì)PLRV的檢測(cè)有目測(cè)法、指示植物鑒別法、免疫檢測(cè)法等，但存在準(zhǔn)確度不高、假陽(yáng)性等問題。建立分子生物學(xué)檢測(cè)法是可靠的病毒鑒定方法，關(guān)于該病毒的研究和鑒定已有相關(guān)報(bào)道[5-11]。高彥萍等[12-13]已經(jīng)建立并優(yōu)化了PLRV 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)體系。陳兆貴等[14]建立了馬鈴薯卷葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)。PLRV 也經(jīng)常在脫毒種苗中檢出[15]，原原種中成為危害嚴(yán)重的病害[16]。聶峰杰等[17]對(duì)寧夏馬鈴薯成熟期PLRV進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)檢出率達(dá)34%，且廣泛種植的6個(gè)馬鈴薯品種均為感病品種。該研究在免疫檢測(cè)法的基礎(chǔ)上，分離了PLRV寧夏分離物，建立了分子生物學(xué)方法，同時(shí)，分析了PLRV寧夏分離物的進(jìn)化關(guān)系。

（3）南相日等[18]利用植物表達(dá)載體構(gòu)建了馬鈴薯卷葉病毒CP蛋白基因，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗卷葉病特性。因此，了解寧夏地區(qū)流行的PLRV對(duì)于利用基因工程培育抗病馬鈴薯新品種有一定的理論意義。

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