北京市鼠形動(dòng)物感染巴爾通體的調(diào)查

李 夫，竇相峰，呂燕寧，孫玉蘭，王小梅，李仁清，陳麗娟，王全意

巴爾通體(Bartonella)屬于革蘭氏陰性菌，能感染宿主的紅細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[1]。巴爾通體種類(lèi)較多，目前已發(fā)現(xiàn)36個(gè)種及亞種，至少有17個(gè)種或亞種對(duì)人和動(dòng)物致病[2]。巴爾通體感染導(dǎo)致的疾病譜較廣，可引起人發(fā)熱、貓抓病、卡里翁病、桿菌性血管瘤病和感染性心內(nèi)膜炎等[3-5]。巴爾通體病常因臨床表現(xiàn)復(fù)雜，癥狀不特異而發(fā)生誤診、漏診[6]。巴爾通體宿主廣泛，可感染多種類(lèi)型的哺乳動(dòng)物，鼠類(lèi)作為巴爾通體的主要宿主，在其存儲(chǔ)和傳播中發(fā)揮重要作用[7-9]。人類(lèi)可因與攜帶巴爾通體的鼠類(lèi)接觸、或被鼠咬傷或是傷口被其排泄物污染而感染，也可能由攜帶巴爾通體的媒介生物如蚤類(lèi)和蜱等叮咬而感染[10]。

北京市周邊生態(tài)環(huán)境良好，鼠形動(dòng)物種類(lèi)豐富。近年來(lái)，隨著人與野外自然環(huán)境接觸頻率的增加，部分鼠傳疾病呈增多趨勢(shì)[11-12]。由于巴爾通體感染導(dǎo)致的疾病尚無(wú)疫苗可預(yù)防，因此對(duì)動(dòng)物宿主和媒介的防制仍為主要防控措施之一。目前，尚未有文獻(xiàn)全面報(bào)道北京市鼠形動(dòng)物感染巴爾通體狀況，為此，本研究調(diào)查北京市16個(gè)區(qū)鼠形動(dòng)物巴爾通體感染狀況和遺傳特征，為制定本地相關(guān)疾病的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2019年3—10月在北京市16個(gè)區(qū)采用夾夜法捕獲鼠形動(dòng)物，通過(guò)記錄捕獲樣本的體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、前后足長(zhǎng)和毛色等形態(tài)特征，根據(jù)鼠科動(dòng)物檢索記錄表進(jìn)行鼠種鑒定[13]。生物安全柜中無(wú)菌操作取動(dòng)物樣本的肝、脾臟，并置于圓形凍存盒中，-70 ℃保存。

1.2 核酸提取 剪取黃豆粒大小的肝、脾臟，使用Qiagen Tissue Lyser II破碎儀進(jìn)行組織破碎，并按DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen，德國(guó))商品化試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行核酸提取，提取的核酸置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 使用文獻(xiàn)報(bào)道的巴爾通體gltA特異引物[14]，上游引物：BhCS.781p(5′-GGGGACCAGCTCATGGTGG-3′)和下游引物：BhCS.1137n(5′-AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2 × AmpliTaq Gold 360 Master Mix(ThermoFisher公司)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，去離子水補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Qiagen QIAxcel電泳儀檢測(cè)，選擇片段大小在379 bp附近的特異性條帶送生工生物有限公司，采用Sanger測(cè)序法，在ABI3730平臺(tái)進(jìn)行DNA序列測(cè)定。

1.4 序列比對(duì)和分析 測(cè)得的序列使用SeqMan軟件進(jìn)行手工校正和拼接，并提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)。使用MEGA 6軟件進(jìn)行序列處理和比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-jointing，NJ)構(gòu)建基于Kimura-2-Parameter(K2P)模型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值設(shè)為1 000次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同特征間的鼠形動(dòng)物陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較的P值采用Boferroni法進(jìn)行校正，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本采集情況 在北京市16個(gè)區(qū)的居室及周邊環(huán)境、山地、林地和農(nóng)田4種生境中，共捕獲鼠形動(dòng)物樣本448只，其中褐家鼠233只、小家鼠92只，主要采集于居民區(qū)及周邊環(huán)境；社鼠53只、中華姬鼠30只、黑線姬鼠25只、巖松鼠6只、倉(cāng)鼠4只、棕背鼠平3只和鼩鼱2只，主要采集于山地、林地和農(nóng)田(表1)。

2.2 樣本檢測(cè)情況 共檢出46份巴爾通體陽(yáng)性樣本，總陽(yáng)性率為10.3%；除巖松鼠，倉(cāng)鼠和棕背鼠平外，各鼠種均有陽(yáng)性檢出；城區(qū)中，海淀區(qū)(15.0%)和石景山區(qū)(28.6%)有陽(yáng)性檢出，其余各區(qū)均為陰性；近郊區(qū)中，順義區(qū)(3.1%)和門(mén)頭溝區(qū)(34.2%)有陽(yáng)性檢出，其余各區(qū)均為陰性；遠(yuǎn)郊區(qū)中，除平谷區(qū)外均有陽(yáng)性檢出，陽(yáng)性率均 >25.0%(表1)。

表1 北京市鼠形動(dòng)物樣本采集及檢測(cè)情況Tab.1 Information on the collection and detection of murine-like animal samples in Beijing

2.3 不同特征鼠形動(dòng)物巴爾通體感染情況 對(duì)不同鼠種之間的巴爾通體陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同鼠種間的陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=114.980，P<0.001)；其中，社鼠(41.5%)、黑線姬鼠(36.0%)和中華姬鼠(30.0%)的陽(yáng)性率顯著高于褐家鼠(0.4%)與小家鼠(4.3%)的陽(yáng)性率，而社鼠、黑線姬鼠和中華姬鼠的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，褐家鼠和小家鼠之間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)不同采樣區(qū)域之間的巴爾通體陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同采樣區(qū)域之間的陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.133，P<0.001)；其中，遠(yuǎn)郊區(qū)的陽(yáng)性率(21.7%)顯著高于近郊區(qū)(6.5%)和城區(qū)(5.9%)的陽(yáng)性率，但近郊區(qū)和城區(qū)之間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)不同生境之間樣本的巴爾通體陽(yáng)性率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示不同生境樣本的陽(yáng)性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=96.466，P<0.001)；其中，山地(33.3%)和林地(31.5%)的陽(yáng)性率顯著高于居室和周?chē)h(huán)境的陽(yáng)性率(1.7%)，但山地和林地間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外，農(nóng)田(8.8%)的陽(yáng)性率顯著低于山地的陽(yáng)性率(表2)。

表2 不同特征鼠形動(dòng)物巴爾通體感染情況Tab.2 Bartonella infections according to different characteristics of murine-like animals

特征樣本數(shù)陽(yáng)性數(shù)(%)χ2值P值 近郊區(qū)21414 (6.5) 遠(yuǎn)郊區(qū)11525 (21.7)采樣生境96.466<0.001 山地6321 (33.3) 林地5417 (31.5) 農(nóng)田343 (8.8) 居室及周?chē)h(huán)境2975 (1.7)

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析 PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，共獲得40條符合質(zhì)量的序列，與GenBank中獲取的國(guó)內(nèi)外33條不同種屬的巴爾通體gltA基因序列進(jìn)行比對(duì)，截齊后的片段對(duì)應(yīng)Bartonellahenselae(L38987.1)gltA基因的堿基位置為823～1085，并基于該部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，40份樣本位于進(jìn)化樹(shù)上的8個(gè)不同分支；其中，25份樣本與巴爾通體(Bartonellaspp.)未定種位于同一個(gè)分支；樣本MTG4、MTG11和HD1與分離自美國(guó)社田鼠的B.grahamii(KT327033.1)親緣關(guān)系最近，序列相似性大于98%；樣本MTG3、MY3、MY6和MY7與B.rattimassiliensis(AY515125.1)親緣關(guān)系最近，相似性大于96%；MTG19和MY32與B.queenslandensis(EU111798.1)親緣關(guān)系最近，相似性大于97%；HD6與B.taylorii(AF191502.1)親緣關(guān)系最近，相似性為92%；YQ7與B.elizabethae(KT327032.1)親緣關(guān)系最近，相似性為96%；HD4、MTG5和YQ1與B.japonica(AB242289.1)親緣關(guān)系最近，相似性大于99%；YQ31與B.phoceensis(AY515126.1)親緣關(guān)系最近，相似性為99%。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上各分支上方數(shù)字為bootstrap值圖1 基于巴爾通體gltA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree constructed on the basis of partial sequences of Bartonella gltA

3 討 論

本研究首次在北京市全市范圍內(nèi)對(duì)鼠傳巴爾通體的感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，鼠形動(dòng)物巴爾通體的總感染率為10.3%，與我國(guó)福建、海南等地報(bào)道的感染率接近[15-16]。我國(guó)各地鼠類(lèi)的巴爾通體感染率差異較大，其中，黑龍江和內(nèi)蒙古等地的感染率可高達(dá)13.8%～57.7%和56.4%，這與當(dāng)?shù)貧夂?、生態(tài)環(huán)境和嚙齒動(dòng)物種群分布有關(guān)[17-18]。北京市地形以山地和平原為主，周邊遠(yuǎn)郊區(qū)域多為山地，城區(qū)和近郊區(qū)多為平原，生態(tài)環(huán)境、鼠形動(dòng)物種群密度和種類(lèi)分布差異較大。本研究結(jié)果顯示，遠(yuǎn)郊區(qū)的陽(yáng)性率(21.7%)顯著高于近郊區(qū)(6.5%)和城區(qū)(5.9%)的陽(yáng)性率，但近郊區(qū)和城區(qū)之間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于巴爾通體宿主具有多樣性，山地、林地等環(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜，動(dòng)物種群豐富，而遠(yuǎn)郊區(qū)樣本多采集于山地、林地，因此，陽(yáng)性率高于城區(qū)或近郊區(qū)的農(nóng)田或居室及周?chē)h(huán)境。不同鼠種間，社鼠和姬鼠陽(yáng)性率(30.0%～41.5%)顯著高于褐家鼠、小家鼠的陽(yáng)性率(0.4%～4.3%)，但姬鼠之間和家鼠之間陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這主要與北京市遠(yuǎn)郊區(qū)山地、林地的優(yōu)勢(shì)鼠種為社鼠和姬鼠，而城區(qū)和近郊區(qū)的居室及周邊環(huán)境的優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠、小家鼠有關(guān)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，本次檢測(cè)到的巴爾通體位于進(jìn)化樹(shù)上的8個(gè)不同分支，其中，25份樣本與巴爾通體(Bartonellaspp.)未定種位于同一個(gè)分支，而其他樣本則分別與7個(gè)不同種巴爾通體聚為一個(gè)分支，同時(shí)，多個(gè)鼠種均可檢出不同種的巴爾通體，表明北京市鼠形動(dòng)物感染巴爾通體具有多樣性特征。本次調(diào)查檢測(cè)到的巴爾通體中，B.grahamii和B.elizabethae被認(rèn)為與人類(lèi)疾病相關(guān)，可導(dǎo)致發(fā)熱、心內(nèi)膜炎和菌血癥等[19]，表明本地鼠形動(dòng)物至少攜帶2種對(duì)人致病的巴爾通體。鼠類(lèi)是多種傳染病病原體的宿主[20-21]，隨著本地農(nóng)業(yè)、旅游和商業(yè)開(kāi)發(fā)等的發(fā)展，對(duì)周邊自然環(huán)境的改造可能會(huì)改變鼠類(lèi)原有生態(tài)環(huán)境，造成鼠類(lèi)遷徙、流竄；同時(shí)，人與自然環(huán)境的接觸頻率增加，使得人類(lèi)感染的概率增加。因此，有效的鼠類(lèi)控制措施，特別是對(duì)遠(yuǎn)郊區(qū)縣的動(dòng)物宿主和傳播媒介的控制，將有助于減少本地人群感染巴爾通體的風(fēng)險(xiǎn)。

利益沖突：無(wú)