2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09流感病毒基因特性分析

孫初陽，崔 磊，潘家興，王如敏，馬 焱，李丹丹

流感病毒是流行性感冒的病原體，主要以呼吸道為侵入門戶，發(fā)病率高、人群普遍易感,可在短時間內引起人群大規(guī)模流行，是常見的急性呼吸道傳染病。流感病毒屬于正黏病毒科，流感病毒屬，可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)4型[1]。甲型流感病毒易變異，人群對新的亞型普遍缺乏免疫力，易引起世界范圍的傳播和大流行，導致嚴重的疾病負擔，被WHO實行全球范圍監(jiān)測[2]。

A(H1N1)pdm09最早被稱為豬源H1N1流感病毒(Swine Origin Influenza A(H1N1)Virus, SOIV)。2009年在美國和墨西哥引起暴發(fā)，并引起全球性流感大流行疫情[3]，隨后A(H1N1)pdm09亞型季節(jié)性流感流行株，繼續(xù)在人群中流行。海南省2009年6月報告首例A(N1N1)pdm09亞型流感病毒輸入性確診病例，并于9月初首次報告省內本地確診病例[4]，至今A(N1N1)pdm09亞型流感病毒在海南省已有10年流行史，很少見其遺傳變異和演化相關方面研究的報道。為進一步了解海南省A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的遺傳變異情況和生物學特點，本文選取14株2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒進行HA和NA基因序列分析，為闡明病原體的分子變異、流行變遷和防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒來源 14株A(HIN1)pdm09亞型流感病毒來自2019-2020年海南省流感參比中心和4家流感監(jiān)測網絡實驗室。哨點醫(yī)院將采集的標本送至對應的流感監(jiān)測網絡實驗室，核酸檢測陽性的標本，接種MDCK細胞和(或)9～11日齡SPF雞胚進行病毒分離培養(yǎng)，培養(yǎng)物經血凝(HA)和血凝抑制(HI)實驗鑒定。跟據《全國流感監(jiān)測技術指南(2017年版)》中規(guī)定流感監(jiān)測年度，本實驗流感監(jiān)測年度時間為2019年4月1日至2020年3月29日。

1.2 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的序列測定和分析 血凝滴度≥8的病毒培養(yǎng)物委托上海伯杰生物科技有限公司進行基因序列測定。MEGA 10.1.8軟件對測定序列與參考株進行比對，采用鄰位歸并法(Neighbour-joining)分別構建HA和NA基因進化樹。從全球共享禽流感數據倡議組織(GISAID)數據庫下載已公布的國內其他省市代表株、北半球疫苗株和國際代表株為參考毒株，DNASTAR7.0.1軟件中MegAlign用于序列核苷酸和氨基酸同源性分析。

1.3 A(HIN1)pdm09亞型流感病毒的抗原性分析

抗原性分析使用標準參考抗原和標準參考抗血清由中國疾病預防控制中心提供，標準參考抗血清經RDE(日本生研)處理，人“O”型血制備紅細胞懸液,抗原性分析中紅細胞凝集(HA)和紅細胞凝集抑制(HI)試驗及標準參考抗血清處理過程詳見《全國流感監(jiān)測技術指南(2017年版)》。

1.4 試劑 病毒RNA提取試劑盒購于QIAGEN公司，RNA提取過程參照RNeasy Mini Kit試劑盒說明書。Real-time RT-PCR檢測試劑盒購于上海之江生物科技有限公司，反應體系、反應條件和結果判定參見說明書。SPF雞胚購于濟南斯帕法斯家禽有限公司。

2 結 果

2.1 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒監(jiān)測情況 2019年4月至2020年3月海南省流感監(jiān)測網絡實驗室分離不同型別流感病毒共489株，A(H1N1)pdm09亞型、H3N2亞型、B型Victoria分別為24、145、320株。海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒與H3N2、B型Victoria亞型流感病毒共同流行，其中H3N2亞型和B型Victoria為優(yōu)勢毒株，A(H1N1)pdm09亞型流感病毒在人群中散發(fā)流行。

2.2 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因同源性分析 14株A(H1N1)pdm09亞型分離株與WHO推薦的北半球疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)、A/Michigan/45/2015 (2017-2019)、A/California/07/2009(2010-2016)進行核苷酸和氨基酸同源性分析顯示(表1)，海南省流感病毒分離株之間 HA 基因核苷酸同源性范圍是98.1%～100%，氨基酸同源性范圍是97.7%～100%。與疫苗株A/California/07/2009 HA基因核苷酸同源性范圍是95.9%～96.8%；氨基酸同源性范圍是95.1%～96.5%。與疫苗株A/Michigan/45/2015 HA基因的核苷酸同源性范圍是97.5%～98.6%；氨基酸同源性范圍是97.5%～98.8%。與疫苗株A/Brisbane/02/2018 HA基因核苷酸和氨基酸同源性范圍分別為98.5%～99.1%和97.7%～99.1%。

表1 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分析Tab.1 Analysis of HA gene nucleotide and amino acid homology of A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

2.3 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因特性分析 本年度按時間和地區(qū)分布選取14株A(H1N1)pdm09亞型流感病毒進行HA基因序列測定并構建核苷酸進化樹(圖1)。HA基因進化樹顯示，海南分離株與WHO推薦的疫苗株A/Brisbane/02/2018(2019-2020)及國內其他省市代表株在同一分支上，依據WHO命名方式[5-6]屬于6B.1分支。進化樹上海南分離株與2019年國內代表株進化關系最近，在同一簇上，2016-2017年國內參考株雖然與海南分離株在同一分支上，但單獨成簇。疫苗株A/California/07/2009(2010-2016)和國外參考毒株與海南分離株分屬不同分支進化關系較遠。與疫苗株A/California/07/2009，A/Michigan/45/2015和A/Brisbane/02/2018相比，14株海南分離株氨基酸在S162N、K163Q、S164T有共同的變異位點，與疫苗株A/Brisbane/02/2018一致，S162N位點的變異增加了一個潛在糖基化位點[5]。另外有6株分離株189位氨基酸發(fā)生Q189E突變，1株N156K氨基酸位點發(fā)生變異(表2)。

表2 A(H1N1)pdm09亞型流感病毒血凝素基因(HA)抗原決定簇位點變異Tab.2 Antigenic determinant site variation of hemagglutinin in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus

注：E.雞胚株；●海南省分離株；■疫苗株圖1 2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA基因進化樹Fig.1 Phylogenetic tree for HA gene in A(H1N1)pdm09 subtype influenza virus from Hainan Province during 2019—2020

2.4 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒NA基因序列分析和進化分析 海南分離株構建NA基因核苷酸進化樹與HA基因核苷酸進化樹基本一致，分離株NA基因與疫苗株A/Brisbane/02/2018在相同分支6B.1上。流感病毒對神經氨酸酶抑制劑敏感性的改變一般是由NA基因中關鍵氨基酸位點突變引起[7]。與疫苗株A/Brisbane/02/2018相比，本次研究中所有A(H1N1)pdm09亞型流感病毒中與神經氨酸酶抑制劑耐藥相關的9個關鍵氨基酸位點E119、Q136、Y155、I223、S247、H275、R293、N295、Q313均未發(fā)生變異。

2.5 海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒抗原性分析 根據HI效價8倍(含8倍)差異判斷[8]，14株海南分離株中，13株為A/Brisbane/02/2018類似株，1株為A/Brisbane/02/2018低反應株。

3 討 論

海南省2009年9月初首次報告省內A(H1N1)pdm09亞型流感病毒確診病例以來，A(H1N1)pdm09亞型流感病毒10年間呈持續(xù)散發(fā)流行態(tài)勢，已經成為季節(jié)性流感主要亞型之一，為防止其再次引發(fā)疫情、危害人類健康和造成社會經濟損失，應繼續(xù)加強A(H1N1)pdm09亞型流感病毒監(jiān)測工作。

甲型A(H1N1)pdm09亞型是新的重組型流感病毒，由于新亞型流感病毒表面抗原HA及NA易發(fā)生變異，可使病毒跨越宿主屏障，2009年引起本世紀首次流感大流行[9]。A(H1N1)pdm09亞型流感病毒基因組包含人、豬和禽流感病毒基因片段,表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸(NA)基因分別來源于古典豬支系及歐亞豬系[10-11]，HA基因可凝集多種動物紅細胞，與細胞表面病毒特異性受體結合，刺激機體產生中和抗體等特性[12]。流感病毒有無感染性與HA前體(HA0)水解成HA1和HA2 2條多肽有關,不同亞型流感病毒HA裂解位點的氨基酸數量不同，例如人H1亞型病毒只有1個精氨酸殘疾(R)裂解位點。本次研究的A(H1N1)pdm09亞型分離株裂解位點中氨基酸序列均呈現為 V321PSI324QSR↓GLFGA，即 HA 裂解位點中只含單個堿性氨基酸 R，附近未見多個連續(xù)堿性氨基酸，屬于低致病性流感病毒特征[13]。

HA基因具有高度變異性[14]，抗原位點氨基酸的變異與流感病毒的抗原性密切相關。A(H1N1)pdm09亞型流感病毒HA1有 4 個抗原決定簇，即 Ca、 Cb、 Sa 和 Sb，其中Ca又分為Ca1和Ca2，共 32個抗原位點[15-16]。海南分離株共同的氨基酸變異位點NQT162-164位于抗原決定簇Sa上，變異位點E189位于Sb抗原決定簇，抗原性分析結果比對中這13株分離株是疫苗株(A/Brisbane/02/2018)的類似株，抗原性無明顯差異，NQT162-164和E189氨基酸位點變異均未影響其抗原性；Sb抗原決定簇上K156位點變異的分離株為低反應株，推測K156位點的變異使A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的抗原性差異顯著。一般HA1蛋白分子2～3個抗原決定簇上發(fā)生4個以上氨基酸位點替換具有流行病學意義[2，17]，海南分離株中7株發(fā)生2個抗原決定簇(Sa和Sb)4個氨基酸位點變異，發(fā)生抗原漂移的分離株占50%，其余分離株未發(fā)生HA蛋白抗原漂移。根據流行株HA基因抗原位點變異情況，WHO推薦2019-2020年北半球流感疫苗組份時，將6B.1分支疫苗株A/Michigan/45/2015(2017-2019)更新成同一分支的A/Brisbane/02/2018，疫苗株匹配性高有更利于A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的防控。

海南分離株HA蛋白在第10、11、23、87、276、287、481、540位保持較穩(wěn)定的糖基化位點，僅在S162N位點增加了一個潛在糖基化位點，一般認為糖基化位點的改變或數目的增減會影響病毒的抗原性或對病毒的穩(wěn)定性、傳染性和致病性產生一定的影響。流感病毒主要通過抗原位點上氨基酸變異和HA糖基化的方式逃避宿主中和抗體的免疫壓力，使疫苗不能對機體產生有效的保護，從而造成疫苗免疫失敗[18]。

NA糖蛋白由RNA節(jié)段6編碼，其主要功能是清除唾液酸，破壞宿主細胞上HA受體，有利于病毒的釋放。NA酶活性中心序列高度保守，目前NA抑制劑研究主要是針對NA酶活性中心和周圍輔助的氨基酸位點[19]。NA氨基酸位點中275和195位點的變異將導致A(H1N1)pdm09亞型流感病毒對神經氨酸酶抑制劑磷酸奧司他韋敏感性降低[20-21]。2019-2020年海南分離株NA基因無氨基酸位點突變，對神經氨酸酶抑制劑敏感，磷酸奧司他韋敏對A(H1N1)pdm09亞型流感病毒仍是有效治療藥物。

海南分離株之間氨基酸和核苷酸序列高度同源，說明本地分離株之間變異小親緣關系近。在HA基因和NA基因進化分析中，國內參考株在HA基因和NA基因進化樹中基本按年份進化分布，沒有呈現明顯的地理分布,說明海南分離株與國內代表株年份差異大于地域差異。

綜上所述，2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒與WHO推薦的疫苗株同源性高，流感疫苗和磷酸奧司他韋敏能夠對海南省A(H1N1)pdm09亞型流感病毒起到有效的預防和治療作用，但仍需加強A(H1N1)pdm09亞型流感病毒的監(jiān)測，及時掌握分子流行病學資料，為A(H1N1)pdm09亞型流感病毒防控提供科學依據。

利益沖突：無