β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒制備工藝優(yōu)化

隨蘭多 王煜 鮑獻(xiàn)杰 黃蘭蘭 葉貝 李妍

摘 要：以β-胡蘿卜素為試驗(yàn)材料，通過(guò)離子交聯(lián)法構(gòu)建β-胡蘿卜素納米粒，在不同藥載比、溫度、pH下研究其載藥率和包封率的變化趨勢(shì)，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。結(jié)果表明：β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的載藥性能最佳工藝條件為藥載比6∶1、溫度30℃、pH 5，在此條件下包封率為61.74%，載藥率16.42%。由此可見，通過(guò)離子交聯(lián)法構(gòu)建β-胡蘿卜素納米粒具有良好的包封率和載藥率。

關(guān)鍵詞：β-胡蘿卜素;殼聚糖;納米粒;載藥性能

中圖分類號(hào) TS264.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）11-0137-04

Optimization the Preparation of β-Carotene-Chitosan Nanoparticles

SUI Landuo et al.

（College of Food and Bioengineering， Bengbu University， Bengbu 233030， China）

Abstract： In this experiment ，β-Carotene were constructed by ion crosslinking method to study their drug loading and encapsulation efficiency under different drug loading ratio， temperature and pH. The results showed that the best technological conditions for β-Carotene chitosan nanoparticles： the drug loading ratio was 6∶1， the temperature was 30℃， the pH was 5， the encapsulation efficiency was 61.74% and the drug loading was 16.42%. The experiment results showed that β-carotene chitosan nanoparticles were stable and the drug loading was good.

Key words： β-Carotene; Chitosan; Nanoparticles; Drug loading properties

類胡蘿卜素是一種天然色素，普遍存在于不同顏色的花卉、蔬菜、水果中，具有抗癌、降血壓、提高免疫力、抗氧化、延緩衰老等保健功效[1]。新鮮的水果和蔬菜富含大量的類胡蘿卜素，是人們獲取類胡蘿卜素的主要來(lái)源，但通過(guò)飲食攝取的類胡蘿卜素生物利用度不到5%[2]。食品中的類胡蘿卜素極其不穩(wěn)定，易被氧化，且主要以結(jié)合蛋白的形式存在于葉綠體或色細(xì)胞等結(jié)構(gòu)中[3]，經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)釋放至消化系統(tǒng)中，然后才能被人體利用。因此，改變類胡蘿卜素的攝取途徑，提高類胡蘿卜素的生物利用度是目前重要的研究課題。殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然的陽(yáng)離子聚合物，自然界中來(lái)源豐富。其結(jié)構(gòu)中有多個(gè)活性官能團(tuán)可改性修飾，便于制成多種藥物遞送系統(tǒng)和組織工程支架，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4]。另外，殼聚糖具有生物降解性、生物相容性、無(wú)毒性、增強(qiáng)免疫等多種生物功能，是良好的藥物載體材料[5]。納米技術(shù)是指在更小分子（如原子等）水平上的研究、制造并利用納米材料（尺寸在1000nm以內(nèi)）的技術(shù)，在醫(yī)藥領(lǐng)域利用其分子結(jié)構(gòu)小的特點(diǎn)，使許多生物活性物質(zhì)可以利用納米技術(shù)來(lái)遞送[6]。.納米粒作為類胡蘿卜素的載體，在提高其生物利用度的同時(shí)，還能增加其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。同時(shí)，納米粒技術(shù)能有效調(diào)節(jié)藥物釋放時(shí)間，尤其在藥物制劑領(lǐng)域，具有改善難溶性藥物溶解度、改善藥物穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[7]。為此，筆者采用離子交聯(lián)法構(gòu)建β-胡蘿卜素納米粒，確定最優(yōu)的制備方案，以β-胡蘿卜素納米粒的包封率和載藥率為考察指標(biāo)，為β-胡蘿卜素的應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 β-胡蘿卜素（AR，上海源葉生物科技有限公司）;殼聚糖鹽酸鹽（食品級(jí)，山東優(yōu)索化工科技有限公司）;殼聚糖（生化試劑，上海凱爾生物技術(shù)有限公司）;三聚磷酸鈉（食品級(jí)，湖北興發(fā)化工集團(tuán)有限公司）;甘油、鹽酸、三氯甲烷，吐溫80、氫氧化鈉、無(wú)水氯化鈣（均為分析純）;一級(jí)純化水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備 TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;085-2A數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力攪拌器（金壇市白塔新寶儀儀器廠）;DW-FL90冰箱（上海子卓?jī)x器有限公司）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）;FA214電子天平（上海海康電子儀器廠）;H4-20KR高速冷凍離心機(jī)（安徽中華中佳科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程 繪制β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線→殼聚糖納米粒的制備→β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的制備→包封率與載藥率的計(jì)算→制備工藝單因素考察→響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件→β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 由文獻(xiàn)得知，β-胡蘿卜素在波長(zhǎng)455nm附近有吸收峰。準(zhǔn)確稱取0.05g的β-胡蘿卜素用三氯甲烷溶解，并用三氯甲烷定容至500mL。移取2、4、6、8、10mL的溶液，三氯甲烷定容至10mL。依照上述操作可得0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的β-胡蘿卜素。然后在波長(zhǎng)455nm處測(cè)定吸光度（三氯甲烷為空白對(duì)照），繪制線性回歸方程：y=0.0138x+0.0150，R2=0.9982（圖1）。

1.3.3 β-胡蘿卜素納米粒的制備 殼聚糖-多聚磷酸鹽納米粒的制備：采用納米復(fù)合技術(shù)制備納米粒，即殼聚糖（CS）與多聚磷酸鈉（TPP）之間發(fā)生離子交聯(lián)反應(yīng)：1mg/mL CS溶解于1%醋酸溶液→緩慢滴加10mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液pH為5→逐滴加入TPP溶液使CS/TPP質(zhì)量比為5∶1，攪拌30min→獲得CS-TPP納米溶液。β-胡蘿卜素納米粒的制備：稱取不同質(zhì)量的β-胡蘿卜素溶解于三氯甲烷中，轉(zhuǎn)速為600r/min，加入至CS-TPP納米溶液控制1d/s，滴加結(jié)束后向混合溶液中加入約占混合溶液總體積的2%的吐溫80，攪拌1.5h可得β-胡蘿卜素納米粒溶液。

1.3.4 包封率和載藥率的計(jì)算 （1）空白殼聚糖納米粒吸光度的測(cè)定：控制藥載比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，pH為3、4、5、6、7，溫度為20、25、30、35、40℃，制備空白殼聚糖納米粒。移取2mL空白殼聚糖納米粒溶液用甲醇定容至10mL，靜置3h后，以甲醇為對(duì)照，在波長(zhǎng)455nm處測(cè)吸光度。（2）β-胡蘿卜素納米粒吸光度的測(cè)定：保持600r/min攪拌1h后，移取2mL β-胡蘿卜素納米粒分別用甲醇和三氯甲烷定容至10mL，靜置2h后，在波長(zhǎng)455nm處測(cè)吸光度。（3）離心后β-胡蘿卜素納米粒吸光度的測(cè)定：向離心管中加入β-胡蘿卜素納米粒溶液，調(diào)節(jié)高速離心機(jī)溫度為5℃，轉(zhuǎn)速為9000r/min，離心30min。取上清液2mL用三氯甲烷定容至10mL，靜置2h后在波長(zhǎng)455nm處測(cè)吸光度。

包封率=[M1-M0M1]

載藥率=[M1-M0M2]

式中：M1為β-胡蘿卜素納米粒的總量;M2為殼聚糖納米粒的總量;M0為游離的β-胡蘿卜素納米粒的總量。

1.3.5 單因素試驗(yàn) （1）反應(yīng)溫度。磁力攪拌處理時(shí)間：1.5h;，攪拌速度：600r/min;加入反應(yīng)液總體積2%的吐溫80;改變磁力攪拌溫度：20、25、30、35、40℃;在反應(yīng)pH為5，β-胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=4∶1的條件下，根據(jù)1.3.3節(jié)方法制備β-胡蘿卜素納米粒并測(cè)定吸光度，計(jì)算載藥率和包封率，平行3次。

（2）藥載比。磁力攪拌處理時(shí)間：1.5h;攪拌速度：600r/min;加入反應(yīng)液總體積2%的吐溫80;改變?chǔ)?胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1;在反應(yīng)pH5，攪拌溫度25℃的條件下，根據(jù)1.3.3節(jié)方法制備β-胡蘿卜素納米粒，并測(cè)定吸光度、計(jì)算載藥率和包封率，平行3次。

（3）反應(yīng)pH。磁力攪拌處理時(shí)間：1.5h;攪拌速度：600r/min;加入反應(yīng)液總體積2%的吐溫80;改變反應(yīng)pH：3、4、5、6、7;在β-胡蘿卜素∶殼聚糖（M∶M）=4∶1，攪拌溫度為25℃條件下，根據(jù)1.3.3節(jié)方法制備β-胡蘿卜素納米粒，并測(cè)定吸光度，計(jì)算載藥率和包封率，平行3次。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得出溫度、pH、藥載比對(duì)納米粒的包封率影響較為明顯，采取Box-benhnken設(shè)計(jì)[9]試驗(yàn)，以溫度、pH、藥載比作為自變量，以β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率與載藥率為試驗(yàn)結(jié)果，表1為試驗(yàn)因素水平編碼。

1.3.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)分析響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的最佳制備條件，并重復(fù)3次，取3次平均值與模型預(yù)測(cè)的理論值進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH 保持藥載比與溫度為不變量，控制pH為單因素變量，得到在不同pH下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖2可知，包封率與載藥率隨pH的不斷增大表現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，pH=5時(shí)包封率和載藥率達(dá)到最大。根據(jù)庫(kù)侖定律，判斷pH=5時(shí)粒子之間的吸引力最強(qiáng)，對(duì)納米粒形成和穩(wěn)定最有利[8]，有利于β-胡蘿卜素和殼聚糖發(fā)生離子交聯(lián)，隨著pH的增大，交聯(lián)聚合物表面的電荷降低。在pH=5時(shí)沒(méi)有發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，粒徑也變化不大[9]。

2.1.2 溫度 保持藥載比與pH為不變量，控制溫度為單因素變量，得到在不同溫度下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖3可知，溫度在25～35℃時(shí)，包封率和載藥率均呈現(xiàn)明顯的上升態(tài)勢(shì)，溫度為35℃時(shí)包封率和載藥率均達(dá)到最高;當(dāng)溫度大于35℃時(shí)，包封率和載藥率又表現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于隨著溫度的上升，殼聚糖分子熱運(yùn)動(dòng)增加，相互碰撞和凝聚作用增大[10]，此時(shí)形成的納米粒子穩(wěn)定性升高，但溫度的持續(xù)升高破壞了納米粒載體結(jié)構(gòu)，達(dá)到了納米粒的沉積溫度，使得納米粒聚集[11]，不利用納米粒的載藥與釋藥。

2.1.3 藥載比 保持溫度與pH為不變量，控制藥載比為單因素變量，得到在不同藥載比下β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的變化情況。由圖4可知，當(dāng)藥載比（X∶1）不斷增大時(shí)，β-胡蘿卜素納米粒的包封率也不斷增大，當(dāng)藥載比=6時(shí)包封率達(dá)到最大值，此后包封率隨藥載比的不斷增大呈下降趨勢(shì)。在此過(guò)程中，小部分納米粒開始聚集，逐漸形成大顆粒[12]，即此時(shí)的納米粒載體仍能繼續(xù)包裹與負(fù)載藥物[13]，但當(dāng)藥載比=6，達(dá)到了納米粒載體的最大限度，繼續(xù)增大藥物的量，包封率與載藥率則不再繼續(xù)增大，反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于溶液剩余的藥物未被納米粒載體包裹與負(fù)載，使得藥物不斷聚集[14]，降低了納米粒載體的穩(wěn)定性，從而使得包封率與載藥率下降。

2.2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面軟件Box-Behnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)，以溫度、藥載比、pH為自由變量，以β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率和載藥率為響應(yīng)值（表2）。采用Design Expert 8.0.6，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率和載藥率二次回歸方程∶Y=20.10+0.15A-0.47B+0.33C-0.14AB+0.12AC-0.055BC-3.79A2+0.88B2-2.50C2。

由表3得出，A、B、C 3個(gè)因素對(duì)模型作用結(jié)果大小為B>C>A，該回歸模型極為顯著（Pr>F小于0.01）模型失擬項(xiàng)P=0.110>0.05，失擬不顯著，表明該模型的建立和試驗(yàn)數(shù)據(jù)的模擬程度一般。利用軟件Box-Behnken得出β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒制備的最佳工藝參數(shù)為溫度30℃、藥載比6∶1、pH 5。在最優(yōu)制備工藝條件下，β-胡蘿卜素殼聚糖納米粒的包封率為61.74%，載藥率為16.42%。

采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)pH、溫度、藥載比進(jìn)行單因素分析，所有試驗(yàn)結(jié)果均以X±s表示，各試驗(yàn)組采用LSD驗(yàn)算，P≤0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)反應(yīng)體系溫度為30℃、藥載比為6∶1、pH為5時(shí)為最優(yōu)反應(yīng)條件。對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，如表4所示。

3 結(jié)論與討論

采用離子交聯(lián)法構(gòu)建β-胡蘿卜素納米粒，以反應(yīng)體系溫度、藥載比、反應(yīng)體系的pH為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，得出3個(gè)單因素對(duì)β-胡蘿卜素納米粒的包封率與載藥率的影響。結(jié)果表明：β-胡蘿卜素納米粒的最佳工藝為反應(yīng)體系溫度30℃、藥載比6∶1、反應(yīng)體系pH5，在此條件下進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)得到包封率為66.49%，載藥率為20.10%，相對(duì)誤差為1.6%。本試驗(yàn)建立的β-胡蘿卜素納米粒制備方法，包封率和載藥率較好，條件穩(wěn)定可靠。

參考文獻(xiàn)

[1]閆見敏，曹克梅，李云洲，等.不同櫻桃番茄品種果實(shí)發(fā)育過(guò)程中類胡蘿卜素的變化規(guī)律[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（04）：46-49.

[2]白喜婷，樊金玲，朱文學(xué)，等.機(jī)械加工及油脂對(duì)南瓜類胡蘿卜素生物接近度的影響[J].食品與機(jī)械，2014，30（5）：3-9.

[3]Schweiggert R M， Mezger D， Schimpf F， et al.Influence of chromoplast morphology on carotenoid bioaccessibility of carrot， mango， papaya， and tomato[J].Food Chemistry，2012，135（4）：2736-2742.

[4]孫仁凇，張建斌，房佳霓，等.殼聚糖納米粒作為藥物遞送系統(tǒng)在癌癥治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2021，26（01）：65-75.

[5]楊夢(mèng)璐，張娜，王方遠(yuǎn)，等.殼聚糖在納米藥物遞送載體領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國(guó)組織工程研究，2021，25（28）：4546-4552.

[6]張金霞，李楠，李曉琴，等.以蛋白質(zhì)為載體的納米制劑質(zhì)量研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2021，30（04）：333-338.

[7]宋林，王琳.納米技術(shù)在藥物制劑研究中的應(yīng)用[J].當(dāng)代化工研究，2020（23）：43-44.

[8]李永，趙修華，祖元?jiǎng)偅?不同pH值與電位耦合對(duì)牛血清白蛋白包被酒石酸長(zhǎng)春瑞濱納米粒制備工藝的影響[J].植物研究，2012，32（03）：377-380.

[9]郭慶發(fā)，虢英榮，曹慧，等.pH敏感電荷反轉(zhuǎn)型姜黃素納米粒子的制備及體外評(píng)價(jià)[J].中草藥，2019，50（03）：598-603.

[10]喻紅英，向娟，林曉春，等.離子凝膠法制備殼聚糖納米粒的影響因素研究[J/OL].今日藥學(xué)：1-9[2021-03-19].

[11]劉淵，賴杰，師金鋒.沉積溫度對(duì)納米碳管-鐵粒子復(fù)合物的制備及吸波性能影響（英文）[J].新型炭材料，2020，35（04）：428-435.

[12]蔡暢，趙燕娜，劉敏.不同藥載比的紫杉醇白蛋白納米粒的制備及釋藥性能研究[J].聊城大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，30（02）：50-55.

[13]邱瀚弘，朱志軍，張雪潔，等.藥載比對(duì)和厚樸酚-分枝狀聚乙二醇聚合物G2納米粒形態(tài)及體外抗腫瘤活性的影響[J/OL].藥物評(píng)價(jià)研究：1-7[2021-03-19].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/12.1409.r.20180926.1515.002.htmL.

[14]李然，陳璐，齊娟，等.南極冰藻DNA光修復(fù)酶脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].化學(xué)與生物工程，2017，34（10）：25-31.

（責(zé)編：徐世紅）