基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討夏枯草對Graves 病的作用機制

李 俊，魏軍平

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

甲狀腺功能亢進癥是由于甲狀腺激素分泌過多而引起的循環(huán)、神經(jīng)、消化系統(tǒng)等興奮性增高和代謝亢進為主要特征的臨床綜合征，其中80%是由Graves ?。℅raves' disease, GD）引起的。甲亢流行病學(xué)因診斷閾值、測定方法及碘營養(yǎng)狀況的差異而不同[1]。歐洲的一項薈萃分析表明患病率約為0.8%，美國調(diào)查顯示為1.3%，而我國的患病率約為0.8%[2,3]。GD 是常見的器官特異性自身免疫疾病之一，甲狀腺刺激性抗體是其特征性致病抗體，存在于90%以上的病人。除自身免疫因素以外，碘營養(yǎng)狀況、心理壓力、性別、吸煙、硒、免疫調(diào)節(jié)劑等也可能導(dǎo)致疾病的發(fā)展[4‐6]。甲亢的主要治療方法是抗甲狀腺藥物、放射性碘和手術(shù)，在美國以外地區(qū)首選ATD 作為主要治療方法，但對于持續(xù)性或復(fù)發(fā)性甲亢患者，應(yīng)使用手術(shù)和放射性碘?？辜谞钕偎幬锟梢种萍谞钕偌に氐暮铣?，但緩解率較低、容易復(fù)發(fā)。放射性碘和手術(shù)見效快，但甲狀腺功能減退、甲狀旁腺功能減退、喉返神經(jīng)損傷等副作用常見，故臨床應(yīng)用受限。中藥治療GD 具有特殊優(yōu)勢，在調(diào)節(jié)機體免疫的同時可以可減少抗甲狀腺藥物所致肝功能異常等毒、副作用，降低復(fù)發(fā)率和甲減發(fā)生率[7]。夏枯草(Prunella vulgaris)味辛、性苦寒，歸肝膽經(jīng)，功能清熱瀉火、明目、散結(jié)消腫等，常用以治療瘰疬、癰腫、眩暈頭痛等。藥理研究表明其具有降壓、降糖、抗菌消炎、免疫抑制、清除自由基及抗氧化、抗腫瘤、抑制病毒生長等多種作用[8]。不少臨床研究表明夏枯草制劑與西醫(yī)治療相結(jié)合可有效降低抗體水平、調(diào)節(jié)異常免疫功能并改善甲狀腺功能，但其臨床作用機制尚未完全明確[9，10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科[11]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，收集夏枯草的治療GD 的有效成分、探究其治療GD 的作用靶點及機制，為夏枯草治療GD 的臨床研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）；Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string‐db.org/）；PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.6.1軟件；PyMOL 2.3.2軟件；AutoDock‐Tools 1.5.6軟件；AutoDock Vina 1.1.2軟件。

1.2 方法

1.2.1 夏枯草活性成分及靶點篩選 從TCMSP 平臺通過檢索并獲取夏枯草的相關(guān)化學(xué)成分［12］。根據(jù)ADME 特性對所獲取的化學(xué)成分進行篩選，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為條件，篩選出符合條件的化學(xué)成分［13，14］。同時應(yīng)用TCMSP 獲取相關(guān)成分的靶點，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將相關(guān)靶點蛋白轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因。

1.2.2 Graves 病相關(guān)靶點獲取 同時檢索Gene‐Cards 數(shù)據(jù)庫及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫，獲取GD相關(guān)的疾病靶點。將兩個數(shù)據(jù)庫中所得靶點結(jié)果合并去重，并將最終所得靶點名標(biāo)準(zhǔn)化。將夏枯草作用靶點與GD 疾病靶點二者取交集，得到夏枯草治療的GD 的關(guān)鍵靶點。

1.2.3 構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò) 使用Cy‐toscape 軟件構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)。以藥物、藥物活性成分、疾病、疾病靶點為節(jié)點，通過Excel 表格構(gòu)建相應(yīng)關(guān)系。然后將表格導(dǎo)入Cyto‐scape 軟件中繪制“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，觀察夏枯草活性成分與疾病靶點之間的相互作用，確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點［12］。

1.2.4 構(gòu)建關(guān)鍵靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建夏枯草治療GD 的蛋白‐蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI network），分析關(guān)鍵靶點蛋白之間的作用關(guān)系。PPI 網(wǎng)絡(luò)中，各個節(jié)點的大小和顏色深淺反映其自由度（Degree）值的大小，其中Degree 值越大代表此節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析 將得到的夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO（gene ontology）生物學(xué)過程和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。以閾值P<0.05 為條件篩選排名靠前的生物學(xué)過程或通路，并使用R 語言繪圖使結(jié)果可視化。

1.2.6 分子對接驗證 從“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)中選取關(guān)鍵活性成分和PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心靶蛋白，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫和PDB 數(shù)據(jù)庫分別下載成分及靶蛋白的結(jié)構(gòu)文件。利用PyMol 軟件將靶蛋白的配體分離并去除水分子，然后將小分子成分和靶蛋白受體使用AutoDockTools 軟件處理并保存為相應(yīng)格式文件。最后利用AutoDock Vina 軟件進行對接驗證，評價夏枯草關(guān)鍵活性成分與核心靶蛋白之間的對接情況。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草化學(xué)成分及作用靶點

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共檢索到的夏枯草的化學(xué)成分有60 個，依據(jù)ADME 特性對成分進行篩選（OB≥30%，DL≥0.18），符合條件的化學(xué)成分有11 個［13］，刪除無靶點信息的化學(xué)成分，最終獲取10個活性成分。見表1。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢符合篩選條件的活性成分的作用靶點并去重，結(jié)果顯示有10 個成分一共作用于198 個靶點，最后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將這些靶點蛋白轉(zhuǎn)換為對應(yīng)基因。

表1 夏枯草化學(xué)成分篩選Tab 1 Selected active constituents of Prunella vulgaris from TCMSP

2.2 夏枯草治療GD 的靶基因篩選

同時使用GeneCards 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫檢索GD 的疾病基因。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選得到靶基因1 467 個，將Relevance score≥20 的155 個納入研究。從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中篩選得到585 個靶基因，將兩個數(shù)據(jù)庫中檢索到的靶基因合并去重后共得到靶基因646 個。比對夏枯草作用靶點基因與GD 疾病靶基因，共篩選出二者的交集靶基因57 個并用于后續(xù)分析，見圖1。

圖1 夏枯草化學(xué)成分作用靶點與Graves病疾病靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of the targets of Prunella vulgaris chemical components and the disease targets of Graves disease

2.3 “藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了深入探究夏枯草的活性成分、作用靶點與疾病靶點之間的關(guān)系。通過Cytoscape 軟件構(gòu)建“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點67 個，其中8 個節(jié)點代表活性成分，57 個節(jié)點代表疾病靶點，節(jié)點相互作用關(guān)系172 條。其中橢圓形代表GD，圓形代表GD 的靶基因，棱形代表夏枯草及其活性成分，節(jié)點之間的連線代表二者之間的相互作用。相連的節(jié)點數(shù)目越多，那么圖形的面積越大，顏色越深（橙色>淺黃色>淺綠色>淺藍色），意味著這個靶點或化合物越在這個網(wǎng)絡(luò)中的作用就越關(guān)鍵。以degree 值為篩選條件，得到槲皮素、木犀草素、山柰酚這3 個成分可能是夏枯草治療GD 的關(guān)鍵成分，見表2。

圖2 夏枯草治療Graves 病“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 "drug-component-disease-target" network diagram of the treatment of Gravse with Prunella vulgans

表2 夏枯草治療GD 的關(guān)鍵成分Tab 2 The key active components of Prunella vulgaris in treating GD

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將上述的57 個關(guān)鍵靶點的數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，從數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出相應(yīng)數(shù)據(jù)并通過Cytoscape軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)共涉及57個靶點及688 條作用關(guān)系。圖中各節(jié)點隨著degree值由小到大，則節(jié)點面積逐漸增大、顏色逐漸加深，且節(jié)點越接近圓心。篩選出degree 值靠前的10 個靶點，預(yù)測這些靶蛋白可能是夏枯草治療GD 的核心靶點見表3。

圖3 夏枯草治療Graves 病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of Prunella vulgaris treatment of Graves disease

表3 夏枯草治療GD 的核心靶點Tab 3 The key targets of Prunella vulgaris in treating GD

2.5 GO 生物功能注釋和KEGG 通路分析

為了進一步探究夏枯草治療GD 的作用機制，對57 個關(guān)鍵靶點進行GO 生物功能注釋和KEGG信號通路分析［15］。GO 富集分析分為生物學(xué)過程、細胞組分及分子功能。從結(jié)果來看，夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點主要涉及的生物過程有：一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、炎癥應(yīng)答（inflammatory response）、對乙醇的反應(yīng)（response to ethanol）、衰老（aging）、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（posi‐tive regulation of transcription from RNA poly‐merase Ⅱpromoter）、凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、藥物反應(yīng)（response to drug）、基因表達的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）；主要存在于細胞外間隙（extracel‐lular space）、胞外區(qū)（extracellular region）、質(zhì)膜外側(cè)（external side of plasma membrane）、線粒體（mito‐chondrion）等；主要參與細胞因子活性（cytokine ac‐tivity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、同一蛋白結(jié)合（identical protein binding）等，見圖4。KEGG 通路分析結(jié)果表明夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點涉及了TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF‐1 信號通路（HIF‐1 signaling pathway）、癌癥相關(guān)通路（pathways in cancer） 、PI3K‐Akt 信 號 通 路（PI3K‐Akt signaling pathway）、細胞因子‐細胞因子‐受體相互作用（cytokine‐cytokine receptor interac‐tion）、癌癥蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）等，見圖5。提示夏枯草可能通過調(diào)控上述信號通路發(fā)揮治療GD 的作用。

圖4 GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis

圖5 KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接

選擇“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵活性成分槲皮素與PPI 網(wǎng)絡(luò)中3 個核心靶蛋白進行分子對接。在PDB 數(shù)據(jù)庫下載AKT1、IL‐6 及TNF的蛋白結(jié)構(gòu)文件，采用Pymol 軟件去掉水分子和配體分子。再用AutoDockTools 軟件進行格式轉(zhuǎn)化并使用AutoDock Vina 軟件進行分子對接［16］，其中Full fitness 值越低，說明靶蛋白與小分子的結(jié)合越緊密，見表4。結(jié)果顯示，槲皮素與3 個靶蛋白均可對接，且槲皮素與AKT1 的對接效果最好（圖6），其次是槲皮素與IL‐6 的對接（圖7），最后是槲皮素與TNF 的對接結(jié)果（圖8）。故預(yù)測夏枯草中的槲皮素與疾病靶點AKT1 的相互作用在夏枯草治療GD 中發(fā)揮著重要作用。

圖6 槲皮素與AKT1 分子對接Fig 6 Molecular docking of quercetin and AKT1

圖7 槲皮素與IL‐6 分子對接Fig 7 Molecular docking of quercetin and IL-6

圖8 槲皮素與TNF 分子對接Fig 8 The docking of quercetin and TNF molecule

表4 分子對接結(jié)果Tab 4 Molecular docking results

3 討論

從“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)圖可知槲皮素、木犀草素、山柰酚等化學(xué)成分是整個網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點。槲皮素作為一種常見的黃酮類化合物，已證實是一種抗甲狀腺激素功能的物質(zhì)，對甲亢和甲狀腺毒性作用有改善效果。在槲皮素抑制FRTL‐5 細胞的生長的實驗中，發(fā)現(xiàn)槲皮素可下調(diào)與甲狀腺合成相關(guān)的部分基因的表達，包括NIS、TSHR、TPO和TG等，動物實驗也表明槲皮素能夠抑制SD 大鼠體內(nèi)碘的攝?。?7］。槲皮素能夠有效改善甲亢誘導(dǎo)的甲狀腺功能變化及肝臟脂質(zhì)過氧化，提高SOD 和CAT 活性，并恢復(fù)肝臟D1 活性［18］。另一方面研究證實山奈酚、槲皮素等均能顯著增加D2 活性，上調(diào)D2 基因的表達并使局部T3 的生成增加，提高骨骼肌細胞氧氣及能量消耗［19］。木犀草素具有廣泛的抗炎作用，但尚缺乏木犀草素治療GD 的實驗研究。此外，“藥物‐成分‐疾病‐靶點”網(wǎng)絡(luò)分析顯示，GD 的靶基因PPARG、PIK3CG、CASP9、AKT1、TNF、ICAM1、BCL2、BAX等與夏枯草活性成分相互作用較多，提示這些靶點是夏枯草治療GD 的潛在靶基因。GD 眼?。℅raves' ophthalmopathy，GO）中眼眶成纖維細胞向脂肪細胞的分化是過氧化物酶體增殖物激活受體G 依賴性過程，其對于GO 致病組織重塑至關(guān)重要［20］。細胞間黏附分子1（ICAM1）是是淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（LFA1）分子的配體，在炎癥和免疫介導(dǎo)中具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)高水平血清ICAM1 與自身免疫性甲狀腺疾病有關(guān)，且抗甲狀腺素過氧化物酶陽性的GD 患者的血清循環(huán)ICAM1 濃度明顯高于陰性的患者［21］。GD 患者甲狀腺濾泡周圍的毛細血管內(nèi)皮細胞和具有單核細胞聚集病變的毛細血管內(nèi)皮細胞中的ICAM1 表達增強，LFA1/ICAM1 通路可能是導(dǎo)致單核細胞遷移到GD 患者甲狀腺的原因［22］。細胞凋亡在多細胞生物的發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用，細胞凋亡與Graves 病甲狀腺實質(zhì)的重塑有關(guān)，并與細胞增殖密切相關(guān)，凋亡的開始與細胞內(nèi)聚力的喪失和Bcl‐2表達的下降有關(guān)［23］。原癌基因Bcl-2與Bax 對細胞凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中Bcl-2是對細胞凋亡有明顯抑制作用。過度表達的Bcl‐2 不僅能抑制甲狀腺細胞凋亡，同時可減少淋巴細胞對甲狀腺細胞的破壞［24］。Casp9 是細胞凋亡蛋白酶活化因子成員之一，通過與Bcl‐2 家族等蛋白因子的相互作用來調(diào)控細胞凋亡的進程［25］。因此，對細胞凋亡過程的調(diào)節(jié)在夏枯草治療GD 中可能發(fā)揮著重要作用。

從PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果可知：AKT1、IL‐6、TNF、VEGFA、TP53、IL‐10、CXCL8 等是夏枯草治療GD的核心靶點。其中，IL‐6、TNF、TP53 等的遺傳變異與GD 發(fā)生風(fēng)險之間存在顯著關(guān)聯(lián)，也顯示了炎癥相關(guān)基因的多態(tài)性與GD 的發(fā)病機制的密切關(guān)系［26，27］。CD40 是一種腫瘤壞死因子受體，是GD 以及多種自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)敏感性基因。甲狀腺CD40 過表達會增加甲狀腺特異性抗體的產(chǎn)生，CD40 通過激活下游細胞因子和趨化因子來介導(dǎo)這種作用，主要包括IL‐6、IL‐8、TNF‐α 等［28］。GD以甲狀腺實質(zhì)的淋巴細胞浸潤為特征，在甲狀腺組織中，輔助Th1 淋巴細胞可能增強TNF‐α 的產(chǎn)生，CXCL8 分泌隨TNF‐α 濃度的增加而呈劑量依賴性增加。這些因子間會建立一個放大的反饋回路，從而啟動并延續(xù)自身免疫過程，CXCL8 可能與疾病的后期慢性持續(xù)階段有關(guān)［29］。IL‐6 是參與B 細胞活化和調(diào)節(jié)脂肪細胞代謝的細胞因子，IL‐6 可能通過增加眼眶脂肪/結(jié)締組織內(nèi)自身抗原的表達而在GO的發(fā)病中起重要作用［30］。此外，活動性GO 的甲狀腺毒性患者的血清VEGF 升高可能反映了眼眶和甲狀腺組織中長期存在的自身免疫過程以及甲狀腺中血管生成的增強，也反映了眼部炎癥活動的程度［31］。這些核心蛋白廣泛參與了GD 發(fā)病中的免疫及炎癥過程，尤其在GO 的發(fā)病中顯得更為重要。

從GO 富集分析結(jié)果可知，夏枯草主要影響GD的炎癥應(yīng)答、凋亡過程的負調(diào)控等相關(guān)生物學(xué)過程等。在Graves 病的初期以Th1 細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)為主，而疾病后期主要是Th2 細胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。因此炎癥應(yīng)答過程的調(diào)節(jié)在GD 的各個時期都是有效的。正常甲狀腺細胞分裂不活躍，細胞凋亡保持在一個較低水平，這種低水平有利于維持腺體的大小和功能的穩(wěn)定［32］。而GD 發(fā)生時甲狀腺細胞增生活躍并伴有細胞凋亡水平的增加。對于凋亡過程的負調(diào)控可能有利于減少毒性淋巴細胞對甲狀腺細胞的破壞作用。KEGG 富集分析結(jié)果表明，夏枯草治療GD 的關(guān)鍵靶點涉及包括TNF 信號通路、HIF‐1 信號通路、PI3K‐Akt 信號通路及癌癥相關(guān)通路。TNF 通路、PI3K‐Akt 通路主要是對炎癥反應(yīng)及細胞凋亡相關(guān)過程的調(diào)控。此外，這些通路與GO 關(guān)系密切，甲狀腺相關(guān)眼病中TSHR 信號直接通過PI3K‐Akt 信號刺激增殖［33］。缺氧也可通過激活眼眶成纖維細胞中的HIF‐1 依賴性途徑來刺激血管生成和脂肪生成，從而影響GO 的組織重塑［34］。GD 與甲狀腺癌發(fā)生率之間的關(guān)系仍存在較大爭議，癌癥相關(guān)通路在疾病中的作用尚需進一步研究。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對夏枯草治療GD 的主要活性成分、關(guān)鍵作用靶點及重要信號通路進行了探討，并通過分子對接對部分成分和靶點進行了驗證。結(jié)果表明，夏枯草的多種活性成分可通過炎癥及細胞凋亡等相關(guān)過程參與GD 的治療，更值得注意的是這些靶點在GO 中表現(xiàn)得更為重要，也為進一步研究其相關(guān)機制奠定了基礎(chǔ)。