電針“神門”對急性心肌缺血模型大鼠心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 表達(dá)的影響

趙麗娜，蔣志明，吳立斌，王敏君，魏小桐，張 帆，崔海玲，王 潔，2，吳子建，2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所，安徽 合肥 230038）

心血管疾病發(fā)病率和死亡率高，目前中國的心血管病患病率仍然處于不斷上升狀態(tài)，死亡率仍居首位，是我國居民死亡的主要原因之一［1-3］。心肌缺血可造成局部的缺血性心肌損傷，逐漸增加心血管疾病負(fù)重［4，5］，影響海馬齒狀回神經(jīng)分化，還可引起海馬區(qū)的認(rèn)知功能障礙［6］，導(dǎo)致心臟與大腦的損傷。第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos‐phate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine mono‐phosphate，cGMP）通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞調(diào)控生理過程［7，8］，對于心血管相關(guān)疾病的發(fā)生也有著重要的作用［9，10］。

前期研究發(fā)現(xiàn)電針對急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）大鼠心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制與下丘腦、海馬等中樞調(diào)控區(qū)域有密切關(guān)系［11，12］，且與血清中效應(yīng)物質(zhì)及多種神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)［13，14］，但是否對血清、心肌和腦組織中cAMP 和cGMP 有影響尚不清楚。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過觀察急性心肌缺血模型大鼠電針后心肌和海馬組織及血清中cAMP 和cGMP 的水平變化，探討電針神門對急性心肌缺血致心腦損傷的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

普通級健康雄性SD 大鼠30 只，購于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：scxk（魯）20190003，體質(zhì)量220～240 g，同條件常規(guī)飼養(yǎng)在康為IR 60 籠具中，溫度（25±5）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和電針組，心電圖異常和模型復(fù)制失敗者剔除，最終每組納入6 只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)全程嚴(yán)格遵守中華人民共和國科技部2006 年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Powerlab 8 導(dǎo)生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments 公司）；華佗牌電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，SDZ-療型）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，BSA124S）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司，Sor‐vall ST 16R）；微量移液器（德國Eppendorf 公司）；微生物培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DHP-9031）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，Spectrophotometer）；一次性使用針灸針（0.25 mm×25 mm，蘇州天協(xié)針灸器械有限公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛（上海源葉生物科技有限公司，Z10M10Y86931）；大鼠肌鈣蛋白T（Tn-T）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060010）；大鼠肌鈣蛋白I（Tn-I）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060007）；大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060015）；大鼠環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，JL20060021）。

1.3 模型復(fù)制及評價(jià)方法

大鼠常規(guī)普通飼料飼養(yǎng)，模型復(fù)制前記錄大鼠肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。參照文獻(xiàn)［15，16］，通過結(jié)扎心臟冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制急性心肌缺血模型。大鼠用10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg 劑量麻醉后仰臥固定，備皮，皮膚用碘伏消毒滅菌，剪開胸骨左緣胸前皮膚，彎頭止血鉗鈍性分離第2、3、4 肋處的胸前肌肉組織，待看到心臟陰影，撐開肋骨，暴露心臟于胸腔外，用6-0 號(hào)醫(yī)用帶線縫合針快速在心臟的冠狀動(dòng)脈左前降支中下部進(jìn)行結(jié)扎，之后將心臟迅速送回胸腔，擠出胸腔內(nèi)的空氣，止血鉗加緊胸部皮膚，防止氣胸，3-0 號(hào)縫合線縫合胸部皮膚。模型復(fù)制過程中全程記錄大鼠肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以T 波高聳或者倒置表示為心肌缺血模型復(fù)制成功。

1.4 穴位選擇與刺激方式

參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［17］常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的針灸穴位定位方法，“神門”穴定位在前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣。從模型復(fù)制后第2 天開始，大鼠在不予其他任何處理情況下固定在特制裝置中，暴露四肢，在雙側(cè)“神門”穴及后方1 mm，各刺入一針灸針，刺入深度1～2 mm，連接電針儀，電流頻率為2 Hz，強(qiáng)度以大鼠爪部輕微抖動(dòng)為度，每次電針15 min，1次/d，連續(xù)電針7 d。正常組和模型組大鼠不予電針。

1.5 檢測指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 心電圖監(jiān)測與分析 針形電極分別插入大鼠左下肢、右下肢、右上肢皮下，采用Powerlab 8 導(dǎo)生理記錄儀采集大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電信號(hào)，通過chart 5 軟件系統(tǒng)內(nèi)置ECG analyze 模塊進(jìn)行分析。

1.5.2 心肌、海馬組織及血清的收集與處理 模型組大鼠于模型復(fù)制后，電針組大鼠于末次電針治療后，用10%水合氯醛溶液，按3 mL/kg 劑量麻醉后剖腹取腹主動(dòng)脈血，4 ℃靜置1 h，4 ℃、3 500 r/min離心20 min，取上清分裝；冰上剪取左心室部位心肌組織，快速取下海馬組織，各稱取50 mg 樣本于玻璃勻漿器中，加入450 μL PBS 溶液充分勻漿，移至EP管中，4 ℃、3 000 r/min 離心20 min，取上清分裝。所有樣品?80 ℃冰箱保存待測。

1.5.3 ELISA 檢測 心肌、海馬組織和血清中肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T 和cAMP、cGMP 的水平取收集的待測樣品冰上緩慢溶解，采用酶聯(lián)免疫分析法（en‐zyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠心肌組織和血清中肌鈣蛋白I（troponin I，cTn-I）和肌鈣蛋白T（troponin T，cTn-T）的水平以及心肌、海馬組織和血清中cAMP 和cGMP 的水平。分別于酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，37 ℃溫育1 h，用醫(yī)用洗滌液洗酶標(biāo)板5次，拍干，加入顯色劑各50 μL 混勻，37 ℃避光顯色15 min，加終止液50 μL，酶標(biāo)儀450 nm 波長處測量各孔的吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循試劑盒說明的操作方法及注意事項(xiàng)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠心電圖改變比較

以Powerlab 8 導(dǎo)生理記錄儀記錄大鼠AMI 模型復(fù)制前后以及電針治療7 d 后心電圖，觀察ST 段的高度以判斷模型復(fù)制成功與否。模型復(fù)制后ST段的高度明顯上升，表示模型復(fù)制成功，電針治療后ST 段下降，心肌缺血狀態(tài)明顯改善。見圖1。

圖1 大鼠心電圖改變的比較Fig 1 Comparison of ECG changes in rats

2.2 電針組大鼠心電圖ST 高度的比較

與模型復(fù)制前相比，模型復(fù)制后的ST 高度明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型復(fù)制后相比，電針治療后的ST 高度明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1、圖2。

圖2 大鼠ST 高度比較Fig 2 Comparison of ST height in rats

表1 大鼠ST 高度比較（mV，n=6，±SEM）Tab 1 Comparison of ST height in rats（mV，n=6，±SEM）

表1 大鼠ST 高度比較（mV，n=6，±SEM）Tab 1 Comparison of ST height in rats（mV，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

組別模型復(fù)制前模型復(fù)制后電針治療后ST height 0.131 5±0.018 0.494 3±0.044**0.076 2±0.050##F P<0.000 1<0.000 1 32.53

2.3 各組大鼠心肌組織和血清cTn-I 和cTn-T 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織cTn-I 和cTn-T 的水平均明顯降低，血清中cTn-I 和cTn-T的水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠心肌組織cTn-I 和cTn-T 的水平均有所升高，血清cTn-I 和cTn-T 的水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）。見表2、表3、圖3。

圖3 大鼠心肌組織和血清cTn-I 和cTn-T 水平比較Fig 3 Comparison of cTn-I and cTn-T content in myocardium and serum of rats

表2 大鼠心肌組織和血清中cTn-I 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 2 Comparison of cTn-I content in myocardium and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表2 大鼠心肌組織和血清中cTn-I 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 2 Comparison of cTn-I content in myocardium and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P<0.01 與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

項(xiàng)目F P血清51.07<0.000 1<0.000 1<0.000 1 0.026 7心肌組織組別正常組模型組電針組正常組模型組電針組cTn‐I 703.7±37.58 1 416±86.15**654.2±42.78##1 470±65.37 1 123±21.33**1 292±16.42#18.10

表3 大鼠心肌組織和血清中cTn-T 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 3 Comparison of cTn-T content in myocardium and serumof rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表3 大鼠心肌組織和血清中cTn-T 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 3 Comparison of cTn-T content in myocardium and serumof rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

項(xiàng)目F P血清86.490<0.000 1<0.000 1 0.034 7 0.042 4心肌組織組別正常組模型組電針組正常組模型組電針組cTn-T 135.40±5.50 480.80±31.31**154.70±17.22##389.70±8.01 353.50±11.07*388.40±8.15#4.966

2.4 各組大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織cAMP 水平明顯升高，海馬組織和血清cAMP 的水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠心肌組織cAMP 水平降低，海馬組織和血清cAMP 的水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）。見表4、圖4。

圖4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較Fig 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats

表4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表4 大鼠心肌、海馬組織和血清cAMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 4 Comparison of cAMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，**P1<0.01 與模型組比較，#P2<0.05，##P2<0.01。

項(xiàng)目血清心肌組織海馬組織正常組11.360±0.326 10.590±0.228 13.170±0.286模型組5.695±0.157**12.560±0.253**11.320±0.319**電針組9.749±0.350##11.590±0.201#12.420±0.216#F P1 P2<0.000 1<0.000 10.023 4 0.000 80.033 0 101.10 18.63 11.28<0.000 1

2.5 各組大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織和血清cGMP 的水平升高，海馬組織cGMP 的水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，電針組大鼠海馬組織cGMP 水平升高，血清中cGMP 的水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），心肌組織cGMP 水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表5、圖5。

表5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

表5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較（pg/mL，n=6，±SEM）Tab 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats（pg/mL，n=6，±SEM）

注：與正常組比較，*P1<0.05，**P1<0.01；與模型組比較，#P2<0.05，##P2<0.01。

項(xiàng)目血清心肌組織海馬組織正常組6.213±0.184 15.460±0.347 18.040±0.227模型組11.160±0.216**17.050±0.419*16.300±0.245**電針組7.036±0.240##16.420±0.244 17.330±0.319#F P1 P2<0.000 1 0.013 60.414 4 0.001 00.392 0 152.500 5.399 10.670<0.000 1

圖5 大鼠心肌、海馬組織和血清cGMP 水平比較Fig 5 Comparison of cGMP content in myocardium，hippocampus and serum of rats

3 討論

心肌肌鈣蛋白是診斷心血管疾病的生物標(biāo)志物之一，cTn-I 和cTn-T 在臨床及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域被視為評價(jià)心肌損傷程度的生物標(biāo)志物［18，19］。研究表明肌鈣蛋白水平的升高與心血管疾病相關(guān)，肌鈣蛋白水平不僅具有評價(jià)心肌疾病的作用，其也可以用來評估臨床梗死及預(yù)后的嚴(yán)重程度［20，21］。在本研究中，模型組心肌組織中cTn-I 和cTn-T 的水平降低，血清中cTn-I 和cTn-T 的水平明顯升高，表示急性心肌缺血模型復(fù)制后造成心肌細(xì)胞損傷，導(dǎo)致心肌組織中cTn-I 和cTn-T 的釋放而降低，血清中cTn-I和cTn-T 的水平升高，電針后心肌組織肌鈣蛋白水平回升，血清中肌鈣蛋白水平明顯下降，這從心肌和血清中肌鈣蛋白的水平變化的角度判斷，證明了電針可以改善心肌缺血造成的心肌細(xì)胞損傷。

cAMP 和cGMP 是機(jī)體中重要的第二信使，接受細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)受體的信號(hào)，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)控生理過程［22］。cAMP 通過腺苷酸環(huán)化酶和蛋白激酶A 相互作用產(chǎn)生一系列反應(yīng)，從而影響細(xì)胞功能［23，24］；cGMP 激活蛋白激酶G 等效應(yīng)因子和核苷酸門控通道以調(diào)節(jié)肌力和代謝等生理病理過程［25-27］。cAMP 和cGMP 均可由磷酸二酯酶降解，其在機(jī)體水平的相對平衡與環(huán)核苷酸降解酶和磷酸二酯酶的活性有關(guān)，cGMP 與PDE2 特異性結(jié)構(gòu)域的結(jié)合會(huì)變構(gòu)地刺激酶的催化速率并導(dǎo)致cAMP濃度降低［28］。cAMP 和cGMP 通過相關(guān)激酶和肽等作用于機(jī)體，參與機(jī)體調(diào)節(jié)作用機(jī)制，在心臟的病理、生理功能方面發(fā)揮重要的作用［24，27］，cGMP 可以影響cAMP 信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的收縮力，心血管疾病的發(fā)生可能導(dǎo)致cAMP 和cGMP 水平的失衡［9，10，28］。本研究發(fā)現(xiàn)電針可以使大鼠心肌組織中升高的cAMP 水平降低，降低海馬組織和血清中升高的cAMP 水平，使血清中升高的cGMP 水平降低，刺激釋放cGMP 而使心肌受損后所致的海馬組織中降低的cGMP 水平升高，但對心肌組織中cGMP 水平變化幾乎沒有影響。電針治療后AMI所致的心肌損傷程度的改善，以及心肌、海馬組織和血清中cAMP 和cGMP 水平的改變，證明了電針“神門”穴改善AMI 所致的心肌細(xì)胞和海馬組織的損傷，可以通過調(diào)節(jié)大鼠心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 水平的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)控生理病理過程而發(fā)揮作用。

研究證實(shí)，電針可以通過釋放體液、心臟保護(hù)因子改善心肌缺血后的恢復(fù)，提高缺血心臟間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率，降低缺血性心臟病產(chǎn)生的對自主神經(jīng)功能的損害［29，30］，激活腺苷受體改善心肌的缺血性損傷［31］，可通過調(diào)節(jié)AngⅡ-TGF-β1通路改善自發(fā)性高血壓所致的心肌纖維化［32］，從而降低心肌缺血導(dǎo)致的心腦損傷。既往研究也證實(shí)了電針手少陰經(jīng)原穴神門穴可以通過影響心肌缺血大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、調(diào)節(jié)下丘腦室旁核神經(jīng)元活動(dòng)、調(diào)節(jié)組織中HCN 通道蛋白及mRNA 的表達(dá)，起到對心肌缺血后心腦損傷的良好改善作用［16，33］。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，通過冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法復(fù)制心肌缺血模型，電針治療前后心電圖的改變以及心肌組織和血清中cTn-I 和cTn-T 水平的變化證實(shí)了模型復(fù)制的可靠性和電針神門穴改善心肌損傷程度的有效性；通過研究心肌和海馬組織以及血清中cAMP 和cGMP 的水平變化，證明了電針“神門”能顯著改善AMI 致心腦損傷的模型大鼠血清和海馬的cAMP、cGMP 以及心肌cAMP 的表達(dá)，但對心肌cGMP 的影響較小。說明了電針“神門”穴改善AMI 后心腦損傷的作用可能與心肌、海馬組織和血清中第二信使cAMP 和cGMP 水平的變化相關(guān)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)控生理病理過程。

本文探討了電針“神門”對AMI 模型大鼠心腦損傷可能保護(hù)作用的分子機(jī)制，為神門穴的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)，但是電針“神門”穴如何參與調(diào)控心肌、海馬組織及血清中cAMP 和cGMP 的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

趙麗娜：主要負(fù)責(zé)本研究的構(gòu)思、設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)的分析和稿件的撰寫，參與了全部實(shí)驗(yàn)過程，蔣志明和吳立斌：參與了動(dòng)物模型的復(fù)制以及取樣，王敏君、魏小桐、張帆和崔海玲：參與了動(dòng)物的電針以及取樣，王潔：參與了本研究數(shù)據(jù)的分析指導(dǎo)及討論，吳子建：參與了實(shí)驗(yàn)及稿件的分析指導(dǎo)、評估和修訂工作。