基于高通量測(cè)序技術(shù)研究靛玉紅對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

梁艷妮，程 雯，吳柯楠，于金高，張東博，張 珍，王 征

? 藥理與臨床 ?

基于高通量測(cè)序技術(shù)研究靛玉紅對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

梁艷妮，程 雯，吳柯楠，于金高，張東博，張 珍，王 征*

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083

研究靛玉紅對(duì)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）模型小鼠腸道菌群的影響及其作用機(jī)制。雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶（125 mg/kg）組和靛玉紅低、中、高劑量（7.5、15.0、30.0 mg/kg）組，采用3% DSS自由飲用7 d誘導(dǎo)小鼠UC模型，第8天ig藥物，連續(xù)干預(yù)7 d后，觀察小鼠體征進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠結(jié)腸組織病理變化；采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；各組收集5份小鼠腸道內(nèi)容物樣本，采用細(xì)菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)高通量測(cè)序，分析小鼠腸道內(nèi)容物的菌群變化。與模型組比較，靛玉紅組小鼠DAI評(píng)分顯著降低（＜0.05），結(jié)腸組織損傷減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，血清中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平顯著降低（＜0.05），抗炎細(xì)胞因子IL-10水平呈升高趨勢(shì)。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，模型組小鼠腸道菌群多樣性降低，靛玉紅組小鼠腸道菌群多樣性升高，在門水平主要表現(xiàn)為擬桿菌門與厚壁菌門比例回升，屬水平7個(gè)菌屬Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group、別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_ UCG_003和可能與靛玉紅對(duì)UC的治療作用相關(guān)。靛玉紅能夠通過調(diào)節(jié)UC小鼠腸道菌群、抑制腸道炎性反應(yīng)，從而治療UC。

靛玉紅；潰瘍性結(jié)腸炎；16S rRNA基因測(cè)序；腸道菌群；多樣性分析

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及直腸、結(jié)腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性結(jié)腸炎性反應(yīng)，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn)，是結(jié)直腸癌的高相關(guān)性疾病[1]。隨著人們生活方式的改變，我國UC患者比例不斷升高[2-4]。UC的發(fā)病機(jī)制普遍認(rèn)為與免疫異常、遺傳易感、環(huán)境因素、腸道菌群失衡等相關(guān)[5]，臨床治療藥物主要有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，長期服用易出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)[6]。中醫(yī)認(rèn)為UC病理因素主要為濕熱、瘀熱、熱毒、痰濁、氣滯、血瘀等，清熱燥濕為其主要治法[7]。青黛為爵床科植物馬藍(lán)(Nees) Bremek.、蓼科植物蓼藍(lán)Ait.或十字花科植物松藍(lán)Fort.的葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末、團(tuán)塊或顆粒，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚的功效，符合中醫(yī)治療UC“清熱利濕、涼血止血”的用藥策略，臨床常使用含青黛的方劑如青黛散、復(fù)方青黛顆粒、清腸溫中方、錫類散、潰結(jié)方等治療UC[8-10]。靛玉紅為天然雙吲哚類化合物，是青黛中的主要成分之一，也是大青葉、板藍(lán)根中的有效成分，臨床用于治療慢性粒細(xì)胞白血病、炎性疾病和腫瘤等[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，靛玉紅能夠干預(yù)UC的發(fā)生和發(fā)展[13-15]。

腸道菌群在人體健康中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，腸道菌群與宿主互利共生，參與重要的代謝、免疫和腸道保護(hù)作用。正常菌群的種類、數(shù)量和比例異常時(shí)，免疫系統(tǒng)失衡、代謝紊亂，導(dǎo)致腸道黏膜損傷。腸道菌群紊亂可能是UC發(fā)生和遷延難愈的主要原因之一[16-18]，因此微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)腸道菌群已成為臨床治療炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的常用手段。本課題組前期研究結(jié)果表明，青黛可以調(diào)節(jié)葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC小鼠腸道菌群失衡，可能與厭氧的革蘭陽性菌曲霉菌屬、消化球菌屬密切相關(guān)[19]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)小鼠腸道菌群進(jìn)行16S RNA基因測(cè)序，對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性變化進(jìn)行深入分析，探究靛玉紅對(duì)DSS誘導(dǎo)UC小鼠腸道菌群的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2015-030。動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)保持12 h明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

靛玉紅（批號(hào)18121203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）購自成都普菲德生物科技有限公司；DSS（批號(hào)S3045）購自美國MP Biomedicals公司；柳氮磺胺吡啶（批號(hào)22200301）購自上海福達(dá)制藥有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為M190322-004a、M190322-104a、M190322-003a）購自欣博盛生物科技有限公司；IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)分別為201908、201908）購自南京森貝伽生物科技有限公司；Stool DNA Kit試劑盒（批號(hào)00D4015040000L10T002）購自美國Omega公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（批號(hào)7E470L0）、VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3（批號(hào)7E401J0）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Prime Star GXL DNA Polymerase（批號(hào)AJ62481A）購自日本Takara公司；Agencourt AMPure XP（批號(hào)17900700）購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 儀器

5424R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；GeneAmp 9700型PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；高通量測(cè)序儀（美國Illumina公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶（125 mg/kg）組和靛玉紅低、中、高劑量（7.5、15.0、30.0 mg/kg）[15]組，每組10只。對(duì)照組飲用純凈水，其余各組自由飲用3% DSS 7 d誘導(dǎo)UC模型。柳氮磺胺吡啶腸溶片研磨后，溶于超純水配制成質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL的混懸液；靛玉紅溶于超純水分別配制成質(zhì)量濃度為0.375、0.750、1.500 mg/mL的溶液。造模后第8天，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積純凈水，1次/d，連續(xù)7 d。自造模第1天起記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀、便血特征，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

DAI＝(體質(zhì)量下降評(píng)分＋大便性狀評(píng)分＋大便隱血情況評(píng)分)/3

表1 DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 靛玉紅對(duì)UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影響

末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，吸入乙醚麻醉，摘眼球取血，3000 r/min離心10 min，吸取血清，按試劑盒說明書檢測(cè)血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平。

2.3 靛玉紅對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

小鼠脫頸椎處死，無菌條件下解剖，距離肛門5 cm處取結(jié)腸段1 cm，于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

2.4 腸道菌群測(cè)序

各組小鼠收集5份腸道內(nèi)容物，采用Stool DNA Kit試劑盒抽提總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，以16S rRNA基因V4～5可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列：上游引物5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTA-3’、下游引物5’-CCCCGYCAATTCMTTTRAG-3’。使用FastPure DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，利用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit純化后采用QuantiFluorTM-ST定量，根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例混合；根據(jù)VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序得到Pair-End（PE）雙端序列，擴(kuò)增子建庫后使用Trimmomatic v0.36和Pear v0.9.6軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)質(zhì)控；利用FLASH v1.2.0和Pear v0.9.6軟件進(jìn)行拼接，利用UCHIME方法去除序列中的嵌合體，采用QIIME v1.8.0軟件中UPARSE聚類法按97%相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類。

2.5 生物信息學(xué)分析

將OTU代表序列對(duì)比16S rRNA數(shù)據(jù)庫，采用RDP分類算法進(jìn)行物種比對(duì)注釋，置信度閾值為0.7，獲得OTU代表序列的分類學(xué)信息，并在各分類水平上分析樣本群落組成?；贠TU聚類結(jié)果采用mothur軟件進(jìn)行α多樣性分析和主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。根據(jù)線性判別分析（liner discriminant analysis，LDA）進(jìn)行LEfSe多級(jí)物種差異判別分析，找出組間在豐度上有顯著差異的物種。

2.6 宏基因組預(yù)測(cè)與分析

PICRUSt軟件可以基于16S rRNA基因測(cè)序得到的OTUs預(yù)測(cè)群落的基因類型與數(shù)量，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）和Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋作功能分析。采用PICRUSt軟件將對(duì)照組、模型組和靛玉紅高劑量組樣品測(cè)序的OTU映射到GreenGene數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行菌群功能和代謝途徑預(yù)測(cè)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 靛玉紅對(duì)UC小鼠DAI評(píng)分的影響

對(duì)照組小鼠活動(dòng)敏捷、攝食正常、體質(zhì)量正常增加、無便血、腹瀉情況；如圖1所示，其余各組小鼠造模后逐漸出現(xiàn)懶動(dòng)、翻毛、扎堆、體質(zhì)量下降、排稀便甚至便血、死亡，造模7 d后小鼠DAI評(píng)分上升到3分，提示UC模型制備成功。各給藥組小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量減輕、腹瀉便血等均有不同程度地改善，DAI評(píng)分顯著降低（＜0.05），表明靛玉紅對(duì)UC具有治療作用。

與模型組比較：*P＜0.05

3.2 靛玉紅對(duì)UC小鼠血清中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高（＜0.05），抗炎因子IL-10水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-8和IL-1β水平顯著降低（＜0.05），柳氮磺胺吡啶組和靛玉紅中、高劑量組小鼠血清中IL-6水平顯著降低（＜0.05），柳氮磺胺吡啶組和靛玉紅低、中劑量組小鼠血清中TNF-α水平顯著降低（＜0.05），表明靛玉紅能夠調(diào)節(jié)UC小鼠體內(nèi)促炎因子和抑炎因子的平衡。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

3.3 靛玉紅對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖3所示，結(jié)腸腸壁由內(nèi)至外依次為黏膜層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層。對(duì)照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，可見明顯的隱窩和大量杯狀細(xì)胞，隱窩邊緣規(guī)則，無炎性細(xì)胞異常浸潤。模型組結(jié)腸黏膜層可見隱窩萎縮和上移，隱窩邊緣不規(guī)則，杯狀細(xì)胞大量減少，中性粒細(xì)胞浸入黏膜層和隱窩。柳氮磺胺吡啶組結(jié)腸結(jié)構(gòu)完整，雖然仍有少量炎性細(xì)胞浸潤，但隱窩和杯狀細(xì)胞已大量可見。靛玉紅組出現(xiàn)大量杯狀細(xì)胞，隱窩結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，炎性細(xì)胞減少。表明靛玉紅能夠緩解DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織損傷。

U型虛線表示隱窩；圓形虛線表示杯狀細(xì)胞；矩形實(shí)線表示中性粒細(xì)胞浸潤

3.4 靛玉紅對(duì)UC小鼠腸道菌群的影響

3.4.1 腸道菌群的物種注釋 如圖4-A所示，經(jīng)Illumina高通量測(cè)序共得到1396個(gè)OTUs，樣本間共有OTUs 267個(gè)。Venn圖可以直觀表現(xiàn)樣本的OTU數(shù)目及各組重疊情況，如圖4-B所示，1056個(gè)OTUs為3組間共有，占比為75.6%，對(duì)照組和模型組共有1211個(gè)OTUs，模型組和靛玉紅高劑量組共有1145個(gè)OTUs，經(jīng)鑒定分別屬于15個(gè)門和208個(gè)屬。

C-對(duì)照組 M-模型組 HINR-靛玉紅高劑量組

如圖5-A所示，在門水平上，各組樣品主要包括擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門等，其中擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度占95%以上，變形菌門次之。經(jīng)Wilcoxon分析，模型組厚壁菌門相對(duì)豐度顯著上調(diào)，擬桿菌門相對(duì)豐度顯著下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組厚壁菌門相對(duì)豐度降低，擬桿菌門相對(duì)豐度升高，但無顯著差異。

如圖5-B所示，在屬水平上，各組樣品相對(duì)豐度較高的菌屬分別為Prevotellaceae_UCG-001、乳酸桿菌屬、另枝菌屬、別樣棒菌屬、Prevotellaceae_UCG-003、擬桿菌屬、Lachnospiraceae_NK4A136_ group、Ruminococcaceae_UCG-014、Rikenellaceae_ RC9_gut_group、、擬普雷沃氏菌屬、_1。與對(duì)照組比較，模型組Prevotellaceae_UCG-001相對(duì)豐度降低，別樣棒菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、擬普雷沃氏菌屬、_1、等相對(duì)豐度升高；與模型組比較，靛玉紅高劑量組PrevotellaceaeUCG-001、_1、別樣棒菌屬和等相對(duì)豐度回調(diào)，表明普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、別樣棒菌屬和等與靛玉紅對(duì)UC的治療作用相關(guān)。

3.4.2 α多樣性分析 Rank-abundance曲線可以分析物種豐度和物種均勻度，水平方向曲線的寬度反映物種豐度，曲線在橫軸上范圍越大則物種的豐度越高；曲線平滑程度反映物種均度，曲線越平緩則物種分布越均勻。Specaccum物種累積曲線描述隨著樣本量增大物種增加的情況，反映了持續(xù)抽樣下新物種出現(xiàn)的速率，可用于判斷樣本量是否充分并估計(jì)物種豐富度。如圖6-A、B所示，隨著測(cè)序深度和樣本量的增加，絕大多數(shù)微生物都能被測(cè)序，且物種豐富度不再隨樣本量增加而增加，表明本研究中測(cè)序深度和樣本量能夠滿足分析需求。α多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，經(jīng)過最低序列數(shù)的樣本數(shù)抽平分析，得到反映群落豐富度的指數(shù)observed_species和反映群落多樣性的指數(shù)Shannon。如圖6-C、D所示，模型組和靛玉紅高劑量組對(duì)腸道菌群物種數(shù)量無顯著影響，但是能夠調(diào)節(jié)不同菌群豐度的消長，使菌群物種多樣性水平產(chǎn)生變化；模型組Shannon指數(shù)降低，靛玉紅高劑量組Shannon指數(shù)升高，表明靛玉紅能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)化其物種多樣性指數(shù)。

圖5 門水平(A) 和屬水平(B) 的樣本物種組成分析

C-對(duì)照組 M-模型組 HINR-靛玉紅高劑量組

3.4.3 β多樣性分析 β多樣性分析利用各樣本序列間的進(jìn)化關(guān)系及豐度信息計(jì)算樣本間距離，反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異。PCoA分析通過對(duì)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序，選擇排在前幾位的最主要特征值表現(xiàn)在坐標(biāo)系里，沒有改變樣本點(diǎn)之間的相互位置而只改變坐標(biāo)系統(tǒng)。基于bray-curtis的PCoA二維圖見圖7，對(duì)照組、模型組和靛玉紅高劑量組樣品的菌群結(jié)構(gòu)具有明顯差異，模型組和靛玉紅高劑量組較為接近，對(duì)照組相對(duì)差距較遠(yuǎn)；模型組和靛玉紅高劑量組菌群輪廓一定程度上分開，表明UC小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，靛玉紅能夠恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)從而治療UC。

圖7 基于bray-curtis的PCoA分析

3.4.4 LEfSe分析 LEfSe分析可以實(shí)現(xiàn)多組間比較，找到組間在豐度上有顯著差異的物種。如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組別樣棒菌屬、擬桿菌屬、大腸志賀氏桿菌，擬普雷沃菌屬、考拉桿菌屬等17種菌屬相對(duì)豐度顯著上調(diào)，Prevotellaceae_UCG_001、別樣桿菌屬、Rikenellaceae_RC9_gut_group、_coprostanoligenes_group、副擬桿菌屬等22種菌屬相對(duì)豐度顯著下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組擬普雷沃菌屬Family_XIII_UCG_001、、Lachnospiraceae_ FCS020_group、_brachy_group、_9、_5、、螺桿菌屬、_group、厭氧棍狀菌屬11種菌屬相對(duì)豐度顯著上調(diào)，別樣棒菌屬、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae_ UCG_003、、_fissicatena_ group、_coprostanoligenes_group、鏈球菌屬、和Erysipelotrichaceae_ UCG_003 9種菌屬相對(duì)豐度顯著下調(diào)；其中靛玉紅能夠顯著上調(diào)模型組中下調(diào)的、Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group[16]等菌屬，顯著下調(diào)模型組中上調(diào)的別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_UCG_003等菌屬，表明靛玉紅對(duì)UC的治療作用與這些菌屬相對(duì)豐度的回調(diào)有關(guān)。

3.4.5 PICRUSt基因預(yù)測(cè)分析 如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)菌趨藥性、孢子形成等功能上調(diào)，核糖體、DNA修復(fù)和重組蛋白質(zhì)、嘧啶代謝、蛋白酶、DNA復(fù)制蛋白、能量代謝、嘌呤代謝、氧化磷酸化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等功能下調(diào)；與模型組比較，靛玉紅高劑量組脂類代謝、細(xì)胞骨架蛋白、氯烷烴和氯烯烴的降解、脂質(zhì)代謝功能上調(diào)，氮代謝、葉酸生物合成、β-丙氨酸代謝、癌癥通路以及二苯乙烯、二庚烷和姜辣素的生物合成等功能下調(diào)。

圖8 各組樣品腸道菌群的LEfSe分析

圖9 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

4 討論

腸道微生態(tài)與消化系統(tǒng)疾病[16,20]、心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、代謝綜合征[21]、腫瘤[22]等關(guān)系密切，腸道菌群在維持腸道穩(wěn)態(tài)及宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和激活中起重要作用。IBD患者體內(nèi)腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，菌群多樣性及豐度下降，出現(xiàn)不穩(wěn)定的菌群，腸道共生菌減少，雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌顯著減少，腸道致病菌及條件致病菌數(shù)量增加，導(dǎo)致腸黏膜損傷[21]。IBD不同發(fā)病時(shí)期腸黏膜菌群結(jié)構(gòu)存在差異[23]?；顒?dòng)期UC患者腸道中的有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌、消化球菌等菌群數(shù)量明顯少于緩解期和健康者，致病菌如大腸桿菌、腸球菌和小梭菌菌群數(shù)量顯著高于緩解期和健康者；緩解期UC患者腸道擬桿菌群數(shù)量明顯低于健康者[24]。腸道菌群可以促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟，腸道菌群產(chǎn)生的信號(hào)分子參與調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的凋亡、增殖和分化，腸道菌群失衡導(dǎo)致IBD患者T細(xì)胞分化異常。目前較多研究使用益生菌、益生元、糞菌移植等恢復(fù)腸道微生物穩(wěn)態(tài)，治療炎性腸病[5]。中醫(yī)根據(jù)UC泄瀉、腹痛的病因病機(jī)，以運(yùn)脾化濕、通利氣機(jī)為治療原則，臨床上常用健脾滲濕、清熱燥濕、活血化瘀等中藥復(fù)方或有效組分，通過增強(qiáng)有益菌且減弱致病菌及條件致病菌扶正祛邪，調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡及免疫反應(yīng)，從而治療UC[25-26]。

青黛咸寒，具有清熱解毒、清腸胃邪熱的功效?！侗窘?jīng)逢原》中記載“青黛，瀉肝膽，散郁火，治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”。靛玉紅能夠通過下調(diào)UC大鼠結(jié)腸組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）表達(dá)水平，上調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，）、腸三葉因子（intestinal trefoil factor，）mRNA表達(dá)水平，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腸道細(xì)胞凋亡和腸道炎性反應(yīng)，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)[15]。靛玉紅能夠降低DSS誘導(dǎo)的UC小鼠血清中促炎因子水平，升高抗炎因子水平，上調(diào)CD4＋T細(xì)胞叉狀頭樣轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和腸上皮細(xì)胞凋亡[14]；靛玉紅能夠抑制UC小鼠核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的活化。本課題組前期研究表明，青黛和色胺酮對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸道微生態(tài)具有調(diào)節(jié)作用，青黛對(duì)UC治療作用可能與曲霉菌屬和消化球菌屬密切相關(guān)，色胺酮對(duì)UC的治療作用可能與Erysipelotrichaceae_UCG_003、Rikenellaceae_ RC9_gut_group和密切相關(guān)[19]。本研究從DAI評(píng)分、結(jié)腸組織形態(tài)及血清中細(xì)胞因子水平證實(shí)靛玉紅對(duì)UC小鼠具有治療作用，能夠調(diào)節(jié)失衡的炎性因子水平；并通過16S RNA基因測(cè)序探究了靛玉紅對(duì)UC小鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)靛玉紅能夠恢復(fù)UC小鼠厚壁菌門與擬桿菌門比例，調(diào)節(jié)不同菌群相對(duì)豐度，加快腸道菌群結(jié)構(gòu)向正常水平恢復(fù)，Lachnospiraceae_FCS020_group、_9、_brachy_group、別樣棒菌屬、鏈球菌屬、Erysipelotrichaceae_UCG_003和可能與靛玉紅對(duì)UC的治療作用密切相關(guān)。

腸道菌群失調(diào)介導(dǎo)的免疫損傷是IBD的重要發(fā)病機(jī)制，但腸道微生態(tài)與IBD的關(guān)系尚未完全明確。本研究從腸道微生物角度探討靛玉紅對(duì)UC小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)靛玉紅對(duì)UC小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性的調(diào)節(jié)作用與其對(duì)UC的治療作用具有相關(guān)性。后續(xù)將進(jìn)一步結(jié)合宏基因組測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)從腸道菌群角度深入研究靛玉紅治療UC的作用機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of indirubin on intestinal flora in mice with ulcerative colitis based on high-throughput sequencing technology

LIANG Yan-ni, CHENG Wen, WU Ke-nan, YU Jin-gao, ZHANG Dong-bo, ZHANG Zhen, WANG Zheng

Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine Resources Industrialization by Shaanxi & Education Ministry, State Key Laboratory of Research & Development of Characteristic Qin Medicine Resources (Cultivation), Shaanxi Innovative Drug Research Center, Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083, China

To investigate the effect and mechanism of indirubin on intestinal flora of mice with ulcerative colitis (UC) induced by dextran sulfate sodium (DSS).Male kunming mice were randomly divided into control group, model group, salazosulfapyridine (125 mg/kg) group, and low-, medium-, high-dose (7.5, 15.0, 30.0 mg/kg) indirubin groups, UC model was induced by free drinking 3% DSS for 7 d. On 8th day, mice were ig drugs, after continuous intervention for 7 d, signs of mice were observed for disease activity index (DAI) score; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of colon tissue; ELISA method was used to detect levels of interleukin-6 (IL-6), IL-8, IL-10, IL-1β and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum of mice. Five samples of intestinal contents in each group were collected, and bacterial 16S rRNA gene V4—V5 regions high-throughput sequencing were used to analyze the flora of intestinal contents variety.Compared with model group, DAI score in indirubin group was significantly reduced (< 0.05), colon tissue damage was reduced, inflammatory cell infiltration was decreased, levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-6, IL-8, IL-1β and TNF-α in serum were significantly decreased (< 0.05), level of anti-inflammatory cytokine IL-10 showed an increasing trend. 16S rRNA gene sequencing results showed intestinal flora diversity of mice in model group was decreased, and intestinal flora diversity in indirubin group was increased; Ratio of Bacteroides/Firmicutes was increased at phylum level, seven genus such as Lachnospiraceae_FCS020_group,_9,_brachy_group,,, Erysipelotrichaceae_UCG_003 andmay be related to the therapeutic effect of indirubin on UC.Indirubin can treat UC by regulating intestinal flora of UC mice and inhibiting intestinal inflammation.

indirubin; ulcerative colitis; 16S rRNA gene sequencing; intestinal flora; diversity analysis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)13 - 3896 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.013

2020-12-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803951）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973687）；陜西省教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目（20JY012）；陜西高校青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（陜教[2019]90號(hào)）；陜西高校第三批“青年杰出人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目（陜教工[2019]95號(hào)）；陜西省首批中醫(yī)藥優(yōu)秀中青年科技骨干人才支持計(jì)劃

梁艷妮（1986—），女，博士，副教授，從事藥物活性評(píng)價(jià)研究。E-mail: aiziji_2005@126.com

王 征，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥活性成分發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)研究。E-mail: wazh0405@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]