基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法

楊 彬，李遇伯, ，張艷軍

·專 論·

基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法

楊 彬1，李遇伯1, 2*，張艷軍2*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617

目前國(guó)家藥典委員會(huì)已采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略開展中藥外源性危害物的限量控制，并逐步開展內(nèi)源性有毒成分風(fēng)險(xiǎn)控制。很多有毒中藥毒性數(shù)據(jù)缺乏，尤其是多基原中藥，化學(xué)成分復(fù)雜，作“同一藥用”的毒理學(xué)表現(xiàn)是否一致？這給風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的第一步危害識(shí)別帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。主要存在2個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：一是毒性機(jī)制報(bào)道較少，信息碎片化，缺乏多種細(xì)胞多條通路綜合考慮毒性結(jié)局；二是品種間成分差異顯著，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，缺乏能整體表征中藥毒性的“等效毒性成分群”。因此，提出構(gòu)建基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法，以期為多基原有毒中藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的構(gòu)建提供技術(shù)支持。

多基原；有毒中藥；風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；危害識(shí)別；單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)

隨著“一帶一路”倡議及“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要的提出，中醫(yī)藥已成為國(guó)家戰(zhàn)略的重要組成部分[1]。特別是中醫(yī)藥在防治新型冠狀病毒肺炎中發(fā)揮了重要作用，中藥大健康產(chǎn)業(yè)已迎來(lái)前所未有的重大發(fā)展機(jī)遇[2]。然而，中藥質(zhì)量均一性及安全性仍是目前制約中藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的瓶頸。如馬兜鈴酸事件等中藥毒性事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重制約了中藥國(guó)際化進(jìn)程。因此，探究中藥質(zhì)量控制及毒性評(píng)價(jià)的理論創(chuàng)新和技術(shù)突破，構(gòu)建以質(zhì)量控制及毒性評(píng)價(jià)為核心的中藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系是推動(dòng)中藥大健康產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。劉昌孝等[3]、雷海民[4]、李菲菲等[5]提出應(yīng)立足于中藥用藥安全需求，在開展中藥材基原、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、安全性等一系列基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上，啟動(dòng)以中藥臨床為導(dǎo)向的中藥安全性評(píng)價(jià)研究，構(gòu)建中藥安全性和質(zhì)量控制體系，有效管控中藥的外源性污染和內(nèi)源性有毒物質(zhì)，從而構(gòu)建中藥藥物警戒大數(shù)據(jù)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)中藥全生命周期的警戒活動(dòng)。

除與機(jī)體因素有關(guān)外，中藥毒性與外源性危害物和內(nèi)源性有毒成分密切相關(guān)，其中內(nèi)源性有毒成分受中藥基原、炮制及加工等外部因素影響。目前國(guó)家藥典委員會(huì)已采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略開展中藥外源性危害物的限量控制，并逐步開展內(nèi)源性有毒成分的風(fēng)險(xiǎn)控制，以客觀認(rèn)識(shí)外部因素引起的中藥安全性問(wèn)題。危害識(shí)別是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的第一步，其核心是對(duì)毒性效應(yīng)、毒性物質(zhì)及毒性機(jī)制進(jìn)行定性描述，并關(guān)注毒性成分遷移代謝及相互作用[6-7]。當(dāng)前很多有毒中藥毒性數(shù)據(jù)缺乏，尤其是多基原中藥，市售藥材品種混雜，不同基原作同一藥用的毒理學(xué)表現(xiàn)是否一致？這為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。主要存在2個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：一是毒性機(jī)制信息碎片化，缺乏從多種細(xì)胞角度綜合考慮毒性結(jié)局；二是品種間成分類別、含量差異顯著，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，缺乏能整體表征中藥毒性的“等效毒性成分群”；因此需采用現(xiàn)代科學(xué)語(yǔ)言評(píng)價(jià)多基原有毒中藥危害識(shí)別的一致性和特征性，以滿足臨床合理用藥的需要。因此，本文提出從危害識(shí)別3個(gè)關(guān)鍵要素即毒性效應(yīng)、毒性物質(zhì)和毒性機(jī)制出發(fā)，充分考慮毒性成分遷移代謝及相互作用，借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、體外-體內(nèi)成分分析及虛擬篩選等多學(xué)科技術(shù)，建立多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法，以期為多基原有毒中藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的構(gòu)建提供技術(shù)支持。

1 基于危害識(shí)別的多基原有毒中藥研究現(xiàn)狀

國(guó)家藥典委員會(huì)提出以“風(fēng)險(xiǎn)控制”為核心開展中藥質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)[8]。近年來(lái)，在廣泛開展中藥重金屬、農(nóng)藥殘留等外源性有害殘留物風(fēng)險(xiǎn)控制研究的基礎(chǔ)上，已逐步開展基于內(nèi)源性有毒物質(zhì)的有毒中藥風(fēng)險(xiǎn)控制研究[9-10]。如補(bǔ)骨脂[11]、山豆根[12]、淫羊藿[13]以及含有雷公藤甲素[14]、馬兜鈴酸[15]等毒性成分的中藥風(fēng)險(xiǎn)控制研究已有報(bào)道。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是風(fēng)險(xiǎn)控制研究的基礎(chǔ)，由危害識(shí)別、危害特征描述、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)特征描述4個(gè)核心步驟組成。危害識(shí)別是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的第一步，即一種因素能引起生物系統(tǒng)或人群發(fā)生不良反應(yīng)作用的類型和屬性的過(guò)程，其核心是對(duì)毒性效應(yīng)、毒性物質(zhì)及毒性機(jī)制進(jìn)行定性表述，并考慮成分遷移代謝及相互作用，見圖1。

圖1 危害識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及中藥質(zhì)量控制的關(guān)聯(lián)

“一藥多源”歷史由來(lái)已久，《中國(guó)藥典》2015年版收載多基原中藥152種，占收錄品種的24.6%[16]。有毒中藥的多基原性導(dǎo)致藥材品種混雜，毒性物質(zhì)及機(jī)制未知，這為有毒中藥的危害識(shí)別帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[17]。此外，由于中藥毒理學(xué)發(fā)展相對(duì)較晚，除少數(shù)品種以外，大多數(shù)有毒中藥不同基原物種間毒性物質(zhì)類別和含量不明確，毒性效應(yīng)和機(jī)制亦未知，多基原有毒中藥臨床互用及同一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是否合理還缺乏科學(xué)闡釋。因此，為保證多基原有毒中藥臨床用藥的安全性和質(zhì)量可控性，亟需以危害識(shí)別為導(dǎo)向，從其關(guān)鍵三要素-毒性效應(yīng)、毒性機(jī)制及毒性物質(zhì)出發(fā)，開展多基原有毒中藥安全性的一致性和特征性研究。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的研究概況

自2009年問(wèn)世以來(lái)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)憑借揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)動(dòng)態(tài)，反映細(xì)胞發(fā)育進(jìn)化以及異質(zhì)性而迅速發(fā)展[18]，并于2013年被列為年度最值得關(guān)注的6大領(lǐng)域榜首，并被評(píng)為年度技術(shù)[19-20]。其技術(shù)流程包括單細(xì)胞捕獲、模板切換法逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA、單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等步驟[21-22]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)偏、可重復(fù)和高通量的轉(zhuǎn)錄分析，再結(jié)合定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光免疫等方法驗(yàn)證，已在組織器官發(fā)育[23]、癌癥異質(zhì)性[24]、藥物敏感性及疾病進(jìn)程[25]等生命現(xiàn)象的精準(zhǔn)剖析中展示巨大的優(yōu)勢(shì)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在中藥領(lǐng)域研究中的應(yīng)用剛剛起步。Zhang等[26]從胃炎-胃癌轉(zhuǎn)化及中醫(yī)治未病角度切入，趙蔚波等[27]提出單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組對(duì)中醫(yī)體質(zhì)的“基本原理”或“關(guān)鍵問(wèn)題”的展望。Liang等[28]采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了高糖影響2-細(xì)胞期胚胎的基因調(diào)控變化，為深入了解左歸丸在糖耐量受損模型上的潛在分子機(jī)制提供了思路。隨著分子生物學(xué)及組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們可從整體性、系統(tǒng)性等多視角對(duì)中藥藥效及毒性的作用機(jī)制進(jìn)行多層次的研究與闡釋。但目前中藥毒性研究主要集中于對(duì)靶器官組織毒性的作用機(jī)制進(jìn)行科學(xué)闡釋，其研究對(duì)象以器官組織為主，而組織由多種異質(zhì)性細(xì)胞組成，單個(gè)細(xì)胞之間的差異導(dǎo)致單個(gè)細(xì)胞屬性被大量細(xì)胞平均屬性掩蓋，無(wú)法獲取數(shù)量較少的細(xì)胞亞群的表達(dá)信息。因此，亟需對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因或蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以判斷細(xì)胞功能、探索細(xì)胞通信層面的毒性作用機(jī)制[29-30]。Wang等[31]和Zhang等[32]提出單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合多維組學(xué)和通路分析，其是評(píng)估靶細(xì)胞精確毒理學(xué)的一種強(qiáng)有力的新方法，引領(lǐng)了系統(tǒng)毒理學(xué)的變革。與平均細(xì)胞反應(yīng)和模糊反應(yīng)細(xì)胞獨(dú)特特性的傳統(tǒng)批量分析不同，單細(xì)胞技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞變化進(jìn)行敏感檢測(cè)，并精確識(shí)別受毒物干擾的細(xì)胞及細(xì)胞亞群，可以提供豐富的信息來(lái)闡明細(xì)胞特異性改變和反應(yīng)軌跡，檢測(cè)起始點(diǎn)，繪制和發(fā)展毒性途徑的動(dòng)力學(xué)模型。目前，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)已應(yīng)用于苯致造血干細(xì)胞毒性[33]、黃曲霉毒素B1肝毒性[34]以及藥物過(guò)敏綜合征[35]等毒性機(jī)制的研究中。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的2大優(yōu)勢(shì)：一是充分考慮細(xì)胞異質(zhì)性，可對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞亞群進(jìn)行分類和功能分析；二是可通過(guò)擬時(shí)序分析描述細(xì)胞分化動(dòng)態(tài)過(guò)程；這決定了其在中藥毒理機(jī)制的精準(zhǔn)剖析具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 有毒中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)的發(fā)現(xiàn)策略

有毒中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特色和復(fù)雜性，毒性物質(zhì)的確定對(duì)于闡明毒性機(jī)制、開發(fā)減毒策略及制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。毒性物質(zhì)基礎(chǔ)研究多借鑒藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究思路，即從體外化學(xué)成分及其代謝物入手，結(jié)合虛擬篩選、組學(xué)技術(shù)及分子生物學(xué)等方法，逐漸發(fā)現(xiàn)與效應(yīng)指標(biāo)相關(guān)聯(lián)的物質(zhì)[36]。

針對(duì)復(fù)雜的中藥體系，必須揭開3個(gè)黑箱才能真正闡明中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)：一是中藥成分的體外遷移及體內(nèi)代謝均會(huì)影響毒性效應(yīng)[37-38]，發(fā)現(xiàn)體外-體內(nèi)的遷移代謝因素對(duì)于識(shí)別毒性物質(zhì)、制定風(fēng)險(xiǎn)控制策略至關(guān)重要。二是中藥多個(gè)毒性成分如何通過(guò)多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)生效應(yīng)呢？組學(xué)技術(shù)的應(yīng)運(yùn)而生為其從多維角度闡釋多成分、多機(jī)制成為可能，結(jié)合虛擬篩選、數(shù)學(xué)計(jì)算等手段，發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)[39]。Wang等[40]采用虛擬篩選、親和色譜及原子力顯微鏡結(jié)合的逐步分析法，發(fā)現(xiàn)中藥藥效/毒效物質(zhì)，這亦為毒性物質(zhì)研究提供借鑒。三是如何整體表征中藥效應(yīng)的“等效毒性成分群”？中藥成分的相互作用均會(huì)影響毒性結(jié)局，可借鑒“等效成分群”思路，根據(jù)活性/毒性物質(zhì)在體內(nèi)靶細(xì)胞含量及比例建立等效性評(píng)價(jià)模型，結(jié)合效應(yīng)指標(biāo)驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)成分清晰、含量確定、毒性等價(jià)及機(jī)制明確的“等效毒性成分群”，闡明中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)[41]。

4 基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究

多基原有毒中藥不同品種化學(xué)成分差異顯著，毒理學(xué)數(shù)據(jù)缺乏，尚不能判斷不同基原中藥的臨床使用風(fēng)險(xiǎn)。為此，課題組以危害識(shí)別為導(dǎo)向，從其三要素即毒性效應(yīng)、毒性機(jī)制和毒性物質(zhì)出發(fā)，考慮成分遷移代謝及相互作用，借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、體外-體內(nèi)成分分析及虛擬篩選等多學(xué)科手段，提出基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法（圖2）。首先明確多基原有毒中藥的靶器官毒性效應(yīng)，隨后采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)考察其毒性分子事件及毒性機(jī)制；再通過(guò)體外-體內(nèi)成分分析，明確不同基原有毒中藥化學(xué)成分遷移代謝規(guī)律；結(jié)合虛擬篩選等手段，經(jīng)細(xì)胞類型分析和毒性通路驗(yàn)證，確認(rèn)能整體表征多基原有毒中藥毒性的“等效毒性成分群”；最后將數(shù)據(jù)整合分析，闡明多基原有毒中藥危害識(shí)別的一致性和特征性。

4.1 多基原有毒中藥靶器官毒性效應(yīng)研究

選擇符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的多基原有毒中藥的不同基原物種，根據(jù)臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道長(zhǎng)期給藥致靶器官組織毒性的用藥規(guī)律，設(shè)定相應(yīng)的給藥劑量和給藥時(shí)間。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行合理分組并設(shè)置不同給藥劑量后，按照給藥方案給藥并飼養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間。收集靶器官組織、血樣，通過(guò)檢測(cè)生化指標(biāo)、細(xì)胞因子表達(dá)以及組織病理切片觀察等手段明確靶器官毒性效應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，繪制關(guān)鍵檢測(cè)指標(biāo)與劑量、時(shí)間變化曲線，即給藥劑量-毒性變化曲線，發(fā)現(xiàn)其毒性趨勢(shì)及關(guān)鍵毒性效應(yīng)指標(biāo)，從機(jī)體水平和器官水平角度，明確多基原有毒中藥靶器官毒性效應(yīng)的一致性和特征性。

圖2 基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法

4.2 基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的靶器官毒性毒理機(jī)制研究

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)可在單細(xì)胞水平分析細(xì)胞群體特征性、定義細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)和基因調(diào)控關(guān)系。在多基原有毒中藥靶器官毒性效應(yīng)研究明確靶器官毒性的基礎(chǔ)上，采用10x Genomics技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，選取靶器官毒性效應(yīng)明顯的樣本以及對(duì)照組靶器官樣本，制備單細(xì)胞混懸液，將制備好的單細(xì)胞懸浮液、10x barcode凝膠磁珠和油滴經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成凝膠微珠乳濁液。先進(jìn)行細(xì)胞裂解，凝膠珠溶解釋放大量引物序列，帶有多聚腺苷酸的RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有10x barcode和分子標(biāo)簽（unique molecular identifiers，UMI）信息的cDNA；再將油滴破碎，收集cDNA產(chǎn)物，進(jìn)行cDNA擴(kuò)增；cDNA擴(kuò)增完成后酶切片段化并篩選合適片段，通過(guò)末端修復(fù)、末端修復(fù)和加A，接頭連接Read2測(cè)序引物，PCR構(gòu)建cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

采用CellRanger、Loupe Cell Browser等軟件對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行可視化分析。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，包括整體質(zhì)控、細(xì)胞基因數(shù)、線粒體基因數(shù)過(guò)濾、UMI數(shù)量與基因數(shù)量相關(guān)性分析以及基因分布。隨后進(jìn)行細(xì)胞聚類及可視化，采用-分布領(lǐng)域嵌入算法（-stochastic neighbor embedding，-SNE）及統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）進(jìn)行單細(xì)胞降維；再進(jìn)行樣本/cluster差異分析，發(fā)現(xiàn)不同樣本間的特征性，去除批次效應(yīng)的影響，判斷不同樣本間是否存在明顯的特征性。再對(duì)-SNE及UMAP聚類可視化展示的細(xì)胞類型定義結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)cluster鑒定到的細(xì)胞類型及所占百分比；采用Heatmap、Ridger Plot、Dot plot圖來(lái)反映基因表達(dá)的水平，由Violin圖衡量某基因作為一個(gè)子群的marker基因的特異性。采用擬時(shí)序分析毒性過(guò)程中細(xì)胞分化程度；基于基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析以及細(xì)胞互作，經(jīng)基因本體論（gene ontology，GO）功能分析、京都基因及基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析以及基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）進(jìn)行功能富集分析，關(guān)注靶器官毒性相關(guān)的信號(hào)通路，最終根據(jù)基因相互作用關(guān)系分別構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)圖，明確靶器官毒性的毒性通路。

為了進(jìn)一步確證靶器官毒性的關(guān)鍵通路，以流式細(xì)胞儀分離關(guān)鍵通路所涉及的主要靶器官細(xì)胞，采用q-PCR方法檢測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的表達(dá)，驗(yàn)證基因表達(dá)的異同。隨后應(yīng)用敲低、基因過(guò)表達(dá)等方法，從細(xì)胞水平出發(fā)，確定這些變化對(duì)毒性異同的直接影響，結(jié)合目的基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，觀察關(guān)鍵蛋白對(duì)應(yīng)基因改變后導(dǎo)致毒性結(jié)局的變化，構(gòu)建靶器官毒性的“核心通路”群，從分子水平和細(xì)胞水平確定關(guān)鍵蛋白與毒性的關(guān)聯(lián)，明確多基原有毒中藥靶器官毒性的細(xì)胞靶標(biāo)、關(guān)鍵細(xì)胞亞群及毒性通路的一致性及特征性。

4.3 基于細(xì)胞類型及靶器官毒性通路的毒性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)

中藥成分遷移及代謝是毒性產(chǎn)生的關(guān)鍵影響因素。采用適當(dāng)?shù)奶崛》椒ǚ謩e制備不同基原物種的提取液。采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)重點(diǎn)檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道的潛在毒性成分，通過(guò)不同組別進(jìn)行比對(duì)，確證潛在毒性成分種類及含量的差異。以靶器官毒性效應(yīng)研究中收集的組織生物樣本，開展不同化學(xué)成分在血樣、不同組織和經(jīng)流式分選的主要靶器官細(xì)胞的檢測(cè)。利用色譜-質(zhì)譜技術(shù)，經(jīng)方法學(xué)考察合格后，準(zhǔn)確檢測(cè)不同生物樣本中潛在毒性成分的含量，明確潛在毒性成分在體外-體內(nèi)全過(guò)程遷移代謝轉(zhuǎn)移率。

在此基礎(chǔ)上，分別將進(jìn)入主要靶器官細(xì)胞的潛在毒性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接等虛擬篩選，初步發(fā)現(xiàn)其潛在直接靶標(biāo)。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的差異基因涉及的蛋白經(jīng)String構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape識(shí)別網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，根據(jù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，逆向篩選關(guān)鍵蛋白相關(guān)聯(lián)的直接靶標(biāo)及對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分。隨后以表面等離子共振等化學(xué)方法為手段，考察化學(xué)成分與關(guān)鍵蛋白的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡解離常數(shù)（D）值，明確化學(xué)成分與篩選的關(guān)鍵蛋白之間親和能力強(qiáng)弱，確證毒性物質(zhì)及直接靶標(biāo)，即為“潛在毒性物質(zhì)”。毒性物質(zhì)的確認(rèn)還需結(jié)合細(xì)胞類型分析和毒性通路進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)“潛在毒性物質(zhì)”進(jìn)入主要靶器官細(xì)胞的成分含量，分別作用于經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的不同類型靶器官細(xì)胞，考察細(xì)胞類型變化以及毒性通路的調(diào)控功能，判斷其對(duì)靶器官毒性的貢獻(xiàn)度，優(yōu)選貢獻(xiàn)度較大的成分即為“毒性物質(zhì)”。

4.4 “等效毒性成分群”的確認(rèn)及危害識(shí)別整合分析

中藥成分的種類、含量及成分比例均會(huì)影響毒性結(jié)局，需尋找能整體表征中藥毒性特征的“等效毒性成分群”。為此，將篩選的毒性物質(zhì)按照檢測(cè)的含量及比例分別作用于相應(yīng)細(xì)胞，獲得多成分對(duì)細(xì)胞狀態(tài)及功能的調(diào)控?cái)?shù)據(jù)。采用聚類分析、k均值聚類算法、單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)方法，與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行多模式整合，根據(jù)細(xì)胞類型和毒性通路發(fā)現(xiàn)能表征整體毒性的“等效毒性成分群”，明確多基原有毒中藥的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)上述研究的毒性效應(yīng)、毒性機(jī)制和毒性物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行整合分析，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-效應(yīng)”網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)縱向和橫向進(jìn)行比對(duì)，從危害識(shí)別的屬性出發(fā)，明確多基原有毒中藥多基原品種產(chǎn)生毒性的異同。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

多基原中藥的基原物種多為近緣物種，其植物形態(tài)和藥材性狀相似，難以準(zhǔn)確鑒別來(lái)源。不同基原物種化學(xué)成分差異顯著，毒理學(xué)數(shù)據(jù)缺乏，目前尚不能準(zhǔn)確判斷不同基原物種的臨床使用風(fēng)險(xiǎn)，影響臨床合理用藥。本文依據(jù)中藥風(fēng)險(xiǎn)控制理念，以危害識(shí)別為導(dǎo)向，從其三要素即毒性效應(yīng)、毒性機(jī)制和毒性物質(zhì)出發(fā)，考慮成分遷移代謝及相互作用，借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、體外-體內(nèi)成分分析及虛擬篩選等多學(xué)科手段，提出多基原有毒中藥危害識(shí)別研究思路及方法。根據(jù)多基原中藥文獻(xiàn)調(diào)研，該研究思路及方法可能會(huì)存在3種研究結(jié)果：一是毒性物質(zhì)基礎(chǔ)不同，毒性通路及效應(yīng)也不同；二是毒性物質(zhì)基礎(chǔ)相同，含量差異導(dǎo)致毒性效應(yīng)不同；三是毒性物質(zhì)基礎(chǔ)不同，但存在結(jié)構(gòu)功能相似性，可能作用通路相同，毒性表現(xiàn)相似。在本文所建立的研究方法的基礎(chǔ)上，如何根據(jù)可能出現(xiàn)的3種結(jié)果綜合制定多基原有毒中藥的風(fēng)險(xiǎn)控制指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)，仍需進(jìn)一步深入研究，以最終為多基原有毒中藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)，保證臨床安全用藥。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research ideas and methods of hazards identification of multi-base source toxic traditional Chinese medicine based on single cell transcriptomics

YANG Bin1, LI Yu-bo1, ZHANG Yan-jun2

1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

Currently, Chinese Pharmacopoeia Commission has adopted the risk assessment strategy to carry out the limited control of exogenous hazards of traditional Chinese medicine (TCM) and gradually carried out the risk management of endogenous toxic compounds in TCM. Chemical composition of multi-base source TCM is significantly different and whether the safety of the “same medicinal product” is consistent still lack of scientific explanation. This brings great challenges to hazard identification, which is the first step of risk assessment. There are two key problems in multi-base source toxic TCM. First, the toxicity mechanism is rarely reported and lack of comprehensive consideration of the toxicity in multiple pathways and various cells in condition of information fragmentation. Second, the basis of toxic substances is not clear, and there is a lack of “equivalent toxic composition group” that can characterize the toxicity of TCM as a whole. Therefore, ideas and methods of hazards identification of multi-base source toxic traditional Chinese medicine based on single cell transcriptomics are proposed to establish in this article, in order to provide technical support for the construction of toxic TCM risk assessment system.

multi-base source; toxic traditional Chinese medicine; risk assessment; hazards identification; single cell transcriptomics

R285.53

A

0253 - 2670(2021)13 - 3783 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.001

2020-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82004225）；天津市人才發(fā)展特殊支持計(jì)劃-高層次創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)

楊 彬（1987—），男，實(shí)驗(yàn)師。E-mail: yang3023008@163.com

李遇伯（1978—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幇踩栽u(píng)價(jià)研究。E-mail: yuboli1@163.com

張艷軍（1967—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚砑鞍踩栽u(píng)價(jià)研究。E-mail: zyjsunye@163.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]