鼻咽癌患者免疫功能狀態(tài)與EBV DNA的相關(guān)性及對(duì)預(yù)后的影響

魏雪玲，蘭美，彭新皓，張菡奕，龍恩，劉會(huì)，郎錦義,

0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是華南地區(qū)最重要的頭頸部惡性腫瘤，放射治療為主要治療方法。隨著放療技術(shù)的發(fā)展和化療方案的不斷完善，鼻咽癌生存率得到改善，目前5年OS高達(dá)80%[1]。盡管鼻咽癌對(duì)放化療敏感，但仍有20%～30%患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。

NPC的發(fā)病機(jī)制與愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus,EBV）密切相關(guān)，其中EBV致癌作用的潛在機(jī)制涉及LMP1、LMP2、microRNA等物質(zhì)[3]。目前血漿中循環(huán)EBV DNA載量已被確定為NPC的腫瘤標(biāo)志物，也被廣泛確立為篩查、監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)NPC疾病進(jìn)展的重要標(biāo)志[4]。病毒能夠感染刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)，除一些非特異的免疫外，也有特異性免疫的產(chǎn)生[5]。特異性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫，在病毒感染的情況下，外周血免疫細(xì)胞的比例將發(fā)生明顯改變，而大量研究顯示免疫細(xì)胞的變化能夠直接影響腫瘤患者的預(yù)后。早期研究中，主要影響鼻咽癌預(yù)后的外周血免疫細(xì)胞包括：CD8+T淋巴細(xì)胞比例、CD44+T淋巴細(xì)胞比例、CD4+/CD8+比值等[6-8]。

目前，免疫治療在鼻咽癌治療中越來越受重視，免疫療法的提出為鼻咽癌的治療提供了新的選擇[9]。EBV作為導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)病的重要病毒因素，其對(duì)患者免疫狀況的影響已被證實(shí)[10]。但是在鼻咽癌患者中有關(guān)EBV與外周血免疫細(xì)胞亞群間的關(guān)系研究較少，這種改變對(duì)患者預(yù)后的影響也尚不清楚。因此，本研究對(duì)NPC患者外周血EBV DNA載量與循環(huán)免疫細(xì)胞亞群的關(guān)系及其對(duì)預(yù)后的影響進(jìn)行探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2016年1月—2019年10月四川省腫瘤醫(yī)院收治的203例初治無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽非角化型癌患者，從病歷中獲取臨床信息（包括性別、年齡、有無慢性病、有無吸煙飲酒史、診斷時(shí)間和治療數(shù)據(jù)）。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次經(jīng)病理明確診斷，并未行治療的NPC；（2）未見其他腫瘤疾病；（3）無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即排除初治時(shí)則轉(zhuǎn)移的NPC（n=11）；（4）對(duì)常規(guī)放化療治療無禁忌；（5）未合并重癥感染者、精神疾病者；（6）無免疫系統(tǒng)疾病及既往未行免疫治療者。

1.2 治療方法

患者均接受了根治性放射治療，在腫瘤靶區(qū)、亞臨床靶區(qū)和淋巴引流區(qū)的中位總劑量分別為70～73 Gy、60～66 Gy和50～54 Gy。其中有111例患者接受了2～3周期誘導(dǎo)化療，然后接受同步放化療2～3周期。其余92例患者直接進(jìn)行同步放化療。誘導(dǎo)化療為含鉑兩藥方案或三藥方案，順鉑+吉西他濱、順鉑+多西他賽或多西他賽+順鉑+氟尿嘧啶。其中多西他賽75 mg/m2，靜脈輸注d1；順鉑75 mg/m2，靜脈輸注d1～3；氟尿嘧啶500 mg/m2，靜脈輸注d1～5；每3周為1周期，誘導(dǎo)化療2～3周期。同步化療藥物為多西他賽+順鉑或單藥順鉑，其中順鉑 75 mg/m2，靜脈滴注d1～3，聯(lián)合或不聯(lián)合使用多西他賽75 mg/m2，靜脈輸注d1，每3周為1周期；或者單藥順鉑30 mg/m2，靜脈滴注，每周方案。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采集NPC患者治療前的肘靜脈血標(biāo)本10 ml（EDTA抗凝）。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析血漿EBV DNA。采用流式細(xì)胞儀分析治療前外周血循環(huán)免疫細(xì)胞亞群，測(cè)定免疫細(xì)胞亞群類型包括：CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、CD56+NK細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+的比值。

1.4 隨訪

末次隨訪時(shí)間為2020年10月，隨訪方式包括門診復(fù)查、住院復(fù)查和電話隨訪等。隨訪后有11例患者失訪；2例復(fù)發(fā)；10例發(fā)生轉(zhuǎn)移（治療后隨訪發(fā)生轉(zhuǎn)移者）；12例死亡，其中3例因其他疾病死亡。治療結(jié)束后2年內(nèi)每3月隨訪1次,2～5年每6月復(fù)查1次,5年以后每年復(fù)查1次。復(fù)查內(nèi)容包括血常規(guī)及生化、EBV DNA、鼻咽鏡及鼻咽MRI、胸片或低劑量胸部CT、腹部超聲和骨掃描。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述，組間比較采用t檢驗(yàn)。采用MedCalc進(jìn)行ROC分析，選取曲線下最大面積所對(duì)應(yīng)的數(shù)值作為界值進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞分組。采用Kaplan-Meier法統(tǒng)計(jì)總生存率（overall survival,OS）、無進(jìn)展生存率（progression-free survival,PFS）、無局部復(fù)發(fā)生存率（local recurrence-free survival,LRFS）、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率（distant metastasis-free survival,DMFS）。采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素預(yù)后相關(guān)分析。采用Prism8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

203例（不包括失訪及因其他原因死亡的患者）初治非轉(zhuǎn)移性鼻咽非角化性癌患者，隨訪截至2020年10月。納入患者年齡18～79歲，中位年齡49歲。按照AJCC第8版鼻咽癌TNM分期進(jìn)行分期。因非高發(fā)區(qū)可能會(huì)存在部分和EB病毒感染相關(guān)度不高的NPC患者，且不同實(shí)驗(yàn)所使用的定量陽性標(biāo)準(zhǔn)模板也不同。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果，將患者分為兩組：EBV DNA≥400 copies/ml組（81例）和EBV DNA＜400 copies/ml組（122例），見表1。

表1 納入鼻咽癌患者一般資料Table 1 General data of included patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC)

2.2 免疫細(xì)胞亞群與臨床參數(shù)的相關(guān)性研究

分析結(jié)果表明，治療前血漿EBV DNA水平與CD19+B細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（r=-0.138,P=0.040），而與其他循環(huán)免疫亞群，包括CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞、CD56+NK細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+的比值，無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。NPC患者年齡與CD3+T細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（r=-0.177,P=0.012），與CD56+NK細(xì)胞比例呈正相關(guān)（r=0.216,P=0.002）?；颊咝詣e與CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.139,P=0.049）。T分期與所有循環(huán)免疫亞群無明顯相關(guān)性（P＞0.05），而N分期與CD3+T細(xì)胞比例（r=0.164,P=0.02）和CD4+T細(xì)胞比例（r=0.14,P=0.046）呈正相關(guān)。外周血CD8+T細(xì)胞比例在不同性別、年齡、吸煙史、飲酒史、慢性病史、T分期、N分期、TNM分期中比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2、圖1。

圖1 治療前鼻咽癌患者EBV DNA與外周血中免疫亞群測(cè)量的特征Figure 1 Characteristics of EBV DNA and immune subsets in peripheral blood of patients with nasopharyngeal carcinoma before treatment

表2 鼻咽癌患者外周血免疫細(xì)胞亞群比例在不同臨床特征中的比較 (x±s) Table 2 Comparison of peripheral blood immune cell subset proportion in NPC patients among different clinical features (x±s)

2.3 EBV DNA載量與生存關(guān)系

研究表明，EBV DNA＜400 copies/ml組和EBV DNA≥400 copies/ml組的3年OS、PFS、DMFS分別為99.2%vs.90.1%（P=0.001），96.7%vs.90.1%（P=0.028），98.4%vs.90.1%（P=0.005），兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EBV DNA＜400 copies/ml組和EBV DNA≥400 copies/ml組的3年LRFS分別為98.4%和100%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2A～D。

圖2 Kaplan-Meier曲線顯示鼻咽癌患者EBV DNA不同分組的總生存率(A)、無進(jìn)展生存率(B)、無轉(zhuǎn)移生存率(C)和無復(fù)發(fā)生存率(D)Figure 2 Kaplan-Meier curves of overall survival(A),progression-free survival(B),distant metastasis-free survival(C) and local recurrence-free survival(D) of NPC patients in different EBV DNA groups

2.4 EBV DNA載量的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，其中引入以下參數(shù)來調(diào)整預(yù)后因素：性別（男性vs.女性），慢性?。ㄓ衯s.無），吸煙史（有vs.無），飲酒史（有vs.無），年齡（≥50歲vs.＜50歲），T分期，N分期，治療前EBV DNA（≥400 copies/mlvs.＜400 copies/ml）。研究表明，EBV DNA載量（P=0.024）是NPC患者3年P(guān)FS的獨(dú)立預(yù)后影響因素，見表3。

表3 鼻咽癌患者臨床特征和EBV DNA的多變量分析Table 3 Multivariable analysis of clinical characteristics and EBV DNA in NPC patients

2.5 循環(huán)免疫細(xì)胞亞群預(yù)測(cè)NPC預(yù)后的ROC分析

經(jīng)ROC分析，選取曲線下最大面積所對(duì)應(yīng)的數(shù)值，NPC患者治療前CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD56+NK細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+比值未找到合適的Cut-off值。而CD19+B細(xì)胞比例以8.33%作為界值預(yù)測(cè)OS、PFS、LRFS、MDFS的準(zhǔn)確度最高。故根據(jù)CD19+B細(xì)胞比例將NPC患者分為CD19+B細(xì)胞低比例組83例（≤8.33%）和CD19+B細(xì)胞高比例組120例（＞8.33%），見圖3。

圖3 鼻咽癌患者治療前循環(huán)免疫細(xì)胞亞群的ROC曲線Figure 3 ROC curves of circulating immune cell subsets in NPC patients before treatment

2.6 CD19+B細(xì)胞的單因素分析

采用Log rank法單因素分析NPC患者治療前CD19+B細(xì)胞比例在預(yù)后中的價(jià)值。本研究表明，治療前NPC患者CD19+B細(xì)胞高比例組（＞8.33%）的3年OS為99.2%，CD19+B細(xì)胞低比例組（≤8.33%）的3年OS為90.4%（P=0.003），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD19+B細(xì)胞高比例組3年時(shí)的PFS為97.5%，而低比例組的3年P(guān)FS為89.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）。治療前NPC患者CD19+B細(xì)胞低比例組與CD19+B細(xì)胞高比例組相比，3年DMFS（90.4%vs.98.3%,P=0.008）較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD19+B細(xì)胞低比例組與CD19+B細(xì)胞高比例組的無復(fù)發(fā)生存率分別為98.8%和99.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 Kaplan–Meier曲線顯示鼻咽癌患者CD19+B淋巴細(xì)胞不同分組的總生存(A)、無進(jìn)展生存(B)、無轉(zhuǎn)移生存(C)、無復(fù)發(fā)生存(D) Figure 4 Kaplan-Meier curves of overall survival(A),progression-free survival(B),distant metastasis-free survival(C) and local recurrence-free survival(D) of NPC patients in different CD19+B lymphocytes groups

2.7 CD19+B細(xì)胞的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。因CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD56+NK細(xì)胞比例以及CD4+/CD8+比值沒有找到合適的Cut-off值，單因素分析對(duì)預(yù)后無明顯意義，則未將這些免疫參數(shù)納入多因素分析。研究表明，CD19+B細(xì)胞比例是鼻咽癌患者3年P(guān)FS（P=0.007）、DMFS（P=0.014）的獨(dú)立預(yù)后影響因素，也是3年OS（P=0.008）的獨(dú)立預(yù)后因素，見表4。

表4 鼻咽癌患者臨床特征和CD19+B細(xì)胞的多變量分析Table 4 Multivariable analysis of clinical characteristics and CD19+B cell in NPC patients

3 討論

目前鼻咽癌主要的治療模式為同步放化療為主的綜合治療，但仍有部分患者發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)因素有：年齡，T、N、M分期和臨床分期，EBV DNA等，但仍不完善。尤其是對(duì)DMFS的預(yù)后，尚未找到很好的預(yù)測(cè)因素。找到可篩選出容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高危鼻咽癌患者的分子生物學(xué)指標(biāo)，是目前急需解決的難題之一。

現(xiàn)有研究已經(jīng)證明EBV和NPC之間有很強(qiáng)的病因?qū)W聯(lián)系，循環(huán)血漿EBV DNA已被確定用于篩查、監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)NPC疾病進(jìn)展的可靠腫瘤標(biāo)志物[3,11]。我們的研究結(jié)果表明，EBV DNA高的NPC患者PFS、OS以及DMFS均低于EBV DNA低的患者，而兩組之間LRFS無明顯差異。在多因素分析中，EBV DNA載量是NPC患者3年P(guān)FS的獨(dú)立預(yù)后影響因素。在一項(xiàng)Meta分析中也得出相似的結(jié)論：治療前EBV DNA水平可預(yù)測(cè)總體生存率、無進(jìn)展生存率、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率和局部區(qū)域衰竭生存率[4]。王敏[12]研究發(fā)現(xiàn)EBV DNA水平能夠輔助進(jìn)行臨床分型，并且能夠指導(dǎo)臨床進(jìn)行預(yù)后的判斷；同時(shí)研究表明治療后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者或復(fù)發(fā)者，EBV DNA水平較無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)者明顯升高。黎晚霞等[13]研究也表示治療前EBV DNA＞1500 copies/ml和≤1500 copies/ml兩組患者的生存預(yù)后具有顯著差異，治療前EBV DNA＞1500 copies/ml是NPC疾病進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

從免疫的角度來看，部分鼻咽癌屬于EBV感染的惡性疾病，鼻咽癌也是一種免疫相關(guān)疾病[14]。病毒能夠感染刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫效應(yīng)，而腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，均與免疫功能狀態(tài)有關(guān)[15]。但有關(guān)鼻咽癌患者中血漿EBV DNA與循環(huán)免疫細(xì)胞亞群之間的相關(guān)性，以及其對(duì)預(yù)后研究較少。本研究結(jié)果顯示，EBV DNA與CD19+B細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)（r=-0.138,P=0.040），而與其他循環(huán)免疫細(xì)胞亞群，包括CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞、CD56+NK細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+的比值，無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。Xu等[16]研究結(jié)果也表示EB病毒載量與CD19+B細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，但其研究也表示EB病毒載量與CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)，與其他循環(huán)細(xì)胞免疫亞群無明顯相關(guān)性。B細(xì)胞是病毒感染的主要靶標(biāo)，CD19是一種分子量為95000的糖蛋白，為最早發(fā)現(xiàn)的B淋巴細(xì)胞系表面標(biāo)志[16-17]。EB病毒載量引起CD19+B細(xì)胞比例改變?cè)谄渌膊≈幸灿邢鄳?yīng)的研究證據(jù)。Fedyanina等[18]研究表示與沒有原發(fā)性EBV感染的傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）患者相比，由原發(fā)性EBV感染引起的經(jīng)典IM兒童的CD19+細(xì)胞的比例較低。本研究同時(shí)表示NPC患者CD19+B細(xì)胞高比例組的OS、PFS以及DMFS均高于CD19+B細(xì)胞低比例組，兩組之間LRFS也無明顯差異。雖然其他循環(huán)免疫細(xì)胞亞群與EBV DNA無相關(guān)性，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)某些循環(huán)免疫細(xì)胞亞群與其他臨床參數(shù)有一定的相關(guān)性。NPC患者年齡與CD3+T細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，與CD56+NK細(xì)胞比例呈正相關(guān)。T分期與所有循環(huán)免疫亞群無明顯相關(guān)性，而N分期與CD3+T細(xì)胞比例和CD4+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)。正如努熱古·阿熱甫等[8]研究發(fā)現(xiàn)局部晚期NPC患者不同年齡階段，CD3+T細(xì)胞比例和NK細(xì)胞比例存在差異,而不同N分期之間CD3+T細(xì)胞比例也不同。

本研究仍具有局限性。首先，該研究所收集數(shù)據(jù)具有一定局限性，未能收集全所有患者治療后EBV DNA數(shù)據(jù)，也未能收集全所有患者循環(huán)細(xì)胞免疫亞群的動(dòng)態(tài)變化，所以未進(jìn)行治療后的分析。其次，本研究屬于回顧性分析，樣本量偏小，存在選擇偏倚，可能對(duì)結(jié)果造成一定影響。未來需要大樣本、多中心、前瞻性臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證來支持目前的發(fā)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療前通過抽取NPC患者少量的外周血進(jìn)行流式分析以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，獲取外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例以及EBV DNA拷貝數(shù)，可以對(duì)NPC的預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，尤其是對(duì)DMFS有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。治療前血漿EBV DNA與外周血中CD19+B細(xì)胞比例存在負(fù)相關(guān)，兩者可作為鼻咽癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。我們或許能以此作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)高危遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行初步篩選，并針對(duì)性地給予個(gè)體化的治療，從而最大限度地消除腫瘤，并對(duì)這些高?；颊哌M(jìn)行更密切的隨訪觀察。病毒感染影響免疫功能，而免疫功能不僅與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)也與患者的預(yù)后顯著相關(guān)[5,19]。我們也可以進(jìn)一步的對(duì)各種循環(huán)免疫亞群細(xì)胞表面的分子標(biāo)記進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步揭示免疫機(jī)制在NPC發(fā)生發(fā)展中的影響，為今后的免疫治療在NPC的開展提供依據(jù)。