2012—2019年中國未知HAdV病毒株分型及基因特征分析

馬驍，劉萬紅

0 引言

人腺病毒（human adenovirus,HAdV）最初由挪威Rowe等于1953年在健康成年人中的扁桃腺樣組織中進(jìn)行分離培養(yǎng)出來，1954年希勒曼對患有急性呼吸道感染的患者進(jìn)行研究，從咽喉分泌物中分離到相同的病毒，1956年，國際病毒委員會（ICTV）將這種病毒命名為人腺病毒[1]。

人腺病毒基因組長約36 kb[2]，含九類基因，按照復(fù)制時(shí)間分為早期轉(zhuǎn)錄基因和晚期轉(zhuǎn)錄基因[3-4]，其中關(guān)于早期表達(dá)與腺病毒有關(guān)的基因?yàn)镋1～E3、E7基因，晚期表達(dá)與腺病毒有關(guān)的基因有5種，為L1～L5基因[4]。

癌癥是造成人類死亡的重要原因之一，對大多數(shù)腫瘤類型來說，目前的醫(yī)療技術(shù)仍無法治愈。溶瘤病毒療法一直被認(rèn)為是一種有前途的抗癌基因治療策略[5]。人腺病毒是研究廣泛的溶瘤病毒之一，能特異性感染并裂解腫瘤細(xì)胞，溶瘤腺病毒療法在治療癌癥方面已經(jīng)取得了一定進(jìn)展[6]。HAdV-C5型人腺病毒是使用最廣泛的溶瘤腺病毒之一，目前有臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HAdV-C5型人腺病毒的中和性免疫阻礙了對人前列腺癌的治療效果[7]，B型溶瘤腺病毒能夠明顯地裂解骨肉瘤細(xì)胞[8]。因此，針對不同癌癥選用合適類型的人腺病毒用于溶瘤腺病毒療法非常重要。

根據(jù)人腺病毒基因組的DNA序列特點(diǎn)、六鄰體蛋白特點(diǎn)、纖突特點(diǎn)以及免疫原性可將人腺病毒分為HAdV-A-G共7個(gè)亞屬[3]，102個(gè)基因型[9]。截至目前，仍有少部分HAdV基因組未能明確分型。為此，本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫中共收集到11株2012—2019年來自中國未明確分型的HAdV完整基因組序列，并收集國內(nèi)外已明確分型的HAdV基因組序列，通過生物信息學(xué)方法對這些未能明確分型的HAdV進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)、基因同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析，從基因?qū)用嫔蠈@些未知HAdV序列進(jìn)行分型。

1 材料與方法

1.1 病毒株來源與基本信息

本研究所需的基因序列全部來自GenBank數(shù)據(jù)庫（https∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。其中11株尚未明確分型的完整HAdV基因組序列均來自中國，另外67株已明確基因型的HAdV病毒株，分別來自HAdV-A到HAdV-G不同亞屬共67個(gè)基因型，以及7株國際上公認(rèn)的HAdV參照基因組序列，將這74株基因組序列作為系統(tǒng)進(jìn)化分析的參照序列。本研究11株未知亞屬病毒株序列的基本信息，包括病毒株收集時(shí)間和地區(qū)、基因登錄號（Accession Numbers）、病毒株的名稱，見表1。

表1 未明確分型的11株HAdV病毒株信息Table 1 Information of 11 unverified HAdV strains

1.2 生物信息學(xué)方法

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用DNA Star軟件中的EditSeq工具將收集到的所有HAdV基因組序列以FASTA格式保存以便于后續(xù)分析[10]。將11株未明確分型的HAdV基因組序列、67株已明確基因型的參照HAdV基因組序列以及7株國際公認(rèn)的HAdV參照序列利用MEGA7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建HAdV病毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析未明確分型的HAdV序列與已知HAdV序列之間的進(jìn)化關(guān)系，選擇Kimura 2-parameter模型，自展次數(shù)選擇1 000次[11]。

1.2.2 基因同源性分析 利用DNA Star軟件中的MegAlign工具將未明確分型HAdV序列與已知序列進(jìn)行比對，分析基因序列之間的同源性，算法選擇Clustal W[10]。

2 結(jié)果

2.1 HAdV基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示：同亞屬的HAdV之間進(jìn)化關(guān)系十分明顯，可以用來推測未明確分型病毒株的進(jìn)化關(guān)系，見圖1。

圖1 基于HAdV基因組數(shù)據(jù)庫構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 1 Phylogenetic tree of whole HAdV genome

MH634393和KF302429兩株HAdV病毒株與D型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；KY002683和KY002684兩株HAdV病毒株與B型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；MK570618的HAdV病毒株與C型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近；MK570619的HAdV病毒株與F型HAdV病毒株序列進(jìn)化關(guān)系較近。剩下5株HAdV病毒株（MH256653、MH256654、MH256655、MH256656、MH256657）相互之間的進(jìn)化關(guān)系比較接近，但是與其他參照病毒株進(jìn)化關(guān)系不是非常明顯，對這5株HAdV病毒株的分型還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 基因組序列同源性分析

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，預(yù)測出6株未明確分型HAdV基因組序列的可能分型，將這6株HAdV序列分別與預(yù)測分型的參照序列進(jìn)行多序列比對分析，觀察基因組序列之間的同源性。

2.2.1 將MH634393和KF302429基因組序列與HAdV-D參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MH634393與D型HAdV參照基因組序列同源性為92.7%，KF302429與D型HAdV參照基因組序列同源性為98.1%，見表2，與之前系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相符合，可以推斷出這兩株未明確類型的HAdV病毒株為D型HAdV。

表2 MH634393、KF302429與D型HAdV基因組多序列比對結(jié)果Table 2 Multiple sequence alignment results among MH634393,KF302429 and HAdV-D genome

2.2.2 將MK570618基因組序列與HAdV-C參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MK570618與3株C型HAdV序列的同源性都比較低，基因組序列上存在較大差異，見表3，與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果不符，推測MK570618不是C型HAdV。

表3 MK570618與C型HAdV基因組序列多序列比對結(jié)果Table 3 Multiple sequence alignment results among MK570618 and HAdV-C genome

2.2.3 將KY002683和KY002684基因組序列與HAdV-B參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KY002683和KY002684之間的同源性是100%，與B1型HAdV基因組序列（NC_011203）的同源性為84.8%，與B2型HAdV基因組序列（NC_011202）的同源性為97.8%，見表4，故推測這兩株HAdV應(yīng)該屬于B2型HAdV，此結(jié)果也與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果相符合。

表4 MH634393、KF302429與B型HAdV基因組多序列比對結(jié)果Table 4 Multiple sequence alignment results among MH634393,KF302429 and HAdV-B genome

2.2.4 將MK570619基因組序列與HAdV-F參照基因組序列以及進(jìn)化關(guān)系最近的基因組序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MK570619和3株HAdV-F的基因組序列之間的同源性較低，只有64.1%～64.4%，見表5。說明MK570619與F型HAdV的基因組序列存在較大差異，推測可能是由于在做系統(tǒng)進(jìn)化分析時(shí)結(jié)果存在一定誤差，排除是F型HAdV的可能性。這株HAdV無法從基因?qū)用嫔蠈ζ浞中?，可能需要通過對其蛋白質(zhì)的分析來推斷出MK570619的分型。

表5 MK570619與F型HAdV基因組多序列比對結(jié)果Table 5 Multiple sequence alignment results among MK570619 and HAdV-F genome

2.2.5 通過系統(tǒng)進(jìn)化分析預(yù)測出了6株未明確分型的HAdV所屬亞屬，但仍有5株進(jìn)化關(guān)系不明顯，無法從系統(tǒng)進(jìn)化分析中推測出具體分型。將這5株HAdV與7株HAdV參照序列（HAdV-A、HAdV-B1、HAdV-B2、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E、HAdV-F）進(jìn)行多序列比對，觀察其同源性特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：這5株HAdV相互之間的序列同源性為100%，應(yīng)屬于同一分型，與B2型HAdV基因組序列的同源性達(dá)到了97.9%，推測這5株HAdV序列應(yīng)該屬于B型HAdV，見表6。

表6 未明確分型HAdV序列類型多序列比對結(jié)果Table 6 Multiple sequence alignment results of unverified HAdV genome

3 討論

人腺病毒是常見的傳染病原體，會引起呼吸道、胃腸道等疾病[12]。在過去幾十年里對于人腺病毒的研究不斷深入，對人腺病毒的治療也有了相應(yīng)的臨床方案。同時(shí)，人腺病毒也是很常用的基因載體，在臨床應(yīng)用方面經(jīng)常用于腫瘤基因治療[13]。

溶瘤腺病毒療法被認(rèn)為是有希望的新型抗癌療法，通過對腺病毒載體的改造，利用病毒特異性靶向殺死腫瘤細(xì)胞[14]。HAdV-C5型人腺病毒作為溶瘤腺病毒已廣泛用于癌癥的臨床治療中，有研究評估了15種不同人腺病毒對前列腺、腎臟腫瘤和骨肉瘤的溶瘤活性。在對20例臨床患者骨肉瘤病理切片觀察中發(fā)現(xiàn)B型溶瘤腺病毒對骨肉瘤細(xì)胞具有殺傷作用，同時(shí)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的自噬過程，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對化療的敏感度[8]。因此，B型HAdV作為溶瘤腺病毒在骨肉瘤治療方面具有較高的臨床應(yīng)用潛力。在人前列腺腫瘤的測試中，HAdV-C5型、HAdV-B11和HAdV-B35型人腺病毒在靜脈注射后造成了較嚴(yán)重的肝毒性，HAdV-C6型毒性相對較小，同時(shí)顯著延緩了腫瘤生長[15]，說明HAdV-C6型人腺病毒比HAdV-C5型、HAdV-B11和HAdV-B35型人腺病毒更適合于人前列腺腫瘤的溶瘤病毒治療。因此并不是所有類型的人腺病毒都可以用于溶瘤病毒治療[9]，找出合適類型的人腺病毒進(jìn)行抗癌治療是十分必要的。

本研究將11株未明確分型的完整HAdV基因組序列進(jìn)行分型，并找出適合做溶瘤腺病毒的病毒株。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示有6株未知的HAdV序列與參照HAdV序列有著很近的進(jìn)化關(guān)系，可以推測出這6株可能的分型。剩余5株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上彼此之間的進(jìn)化關(guān)系很接近，但是與參照序列無明顯進(jìn)化關(guān)系，無法通過系統(tǒng)進(jìn)化分析來判別其類型。

對之前已推測出可能類型的HAdV序列與各自參照序列進(jìn)行多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)：KY002683和KY002684基因組序列與HAdV-B參照基因組序列之間的同源性為97.8%，綜合系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果判斷出這兩株HAdV應(yīng)該屬于B型HAdV；MH634393和KF302429基因組序列與HAdV-D參照基因組序列之間的同源性分別為92.7%和98.1%，推測這兩株HAdV應(yīng)該屬于D型HAdV；剩余兩株為MK570618和MK570619的HAdV與系統(tǒng)進(jìn)化分析得出的可能類型的參照序列之間同源性較低，與進(jìn)化分析結(jié)果不一致，無法從基因?qū)用嫔吓袛喑鲞@兩株病毒的類型，可能還需要進(jìn)一步對這兩株病毒株的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相關(guān)分析才能判斷出其分型。

剩余5株HAdV基因組序列未能從系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果上推斷出病毒類型，可能是由于HAdV之間本身的差異比較小，導(dǎo)致系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較接近，于是將這5株HAdV基因組序列與HAdV-AHAdV-F參照序列進(jìn)行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這5株HAdV的序列與B型HAdV基因組序列的同源性達(dá)到了97.9%，推測這5株應(yīng)該屬于B型HAdV，這5株B型HAdV病毒株與之前分型的兩株B型HAdV病毒株可能適合作為溶瘤腺病毒進(jìn)行骨肉瘤治療的相關(guān)研究。

本文對2012—2019年在中國發(fā)現(xiàn)的11株未分型HAdV病毒株的基因組序列進(jìn)行了初步研究，對其中9株病毒株進(jìn)行了分型，并找出7株可能適合作為溶瘤腺病毒的B型HAdV病毒株，為之后對未知HAdV病毒株的分型以及溶瘤腺病毒類型的選擇提供了一定思路。