愛玉子上幼期愛玉子榕小蜂與蟲癭的協(xié)同發(fā)育

吳婷婷, 吳文珊, 陳友鈴,*, 黃 鎮(zhèn), 周蓮香

(1. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350117;2. 臺灣大學(xué)生態(tài)學(xué)與演化生物學(xué)研究所, 臺北 10617)

愛玉子Ficuspumila.var.awkeotsang雌雄異株，隸屬于?？?Moraceae)榕屬Ficus，分布于我國臺灣、福建、浙江，分布在海拔800-1 800 m的山地(中國植物志編輯委員會, 1998)。20世紀(jì)80年代，經(jīng)過野生馴化實(shí)現(xiàn)了愛玉子立地栽培，現(xiàn)已成為我國南方特有果樹，其瘦果含有大量的果膠和果膠酶，可以制成風(fēng)味獨(dú)特、清涼消暑的冷飲(林贊標(biāo)等, 1990; 賴柏全, 2010)。愛玉子榕小蜂Wiebesiasp. nr.pumilae(薜荔榕小蜂Wiebesiapumilae的相近種)屬膜翅目(Hymenoptera)榕小蜂科(Agaonida)，是愛玉子的專性傳粉榕小蜂(江少華, 2011; 吳文珊等, 2013a)，沒有榕小蜂傳粉愛玉子無法結(jié)實(shí)，沒有愛玉子提供癭花為產(chǎn)卵場所，榕小蜂就無法繁殖后代，榕小蜂與榕樹間維持著長期穩(wěn)定的互利共生關(guān)系(林贊標(biāo)等, 1990; 吳文珊和陳友鈴, 2008; 賴柏全, 2010)。榕小蜂幼蟲在蟲癭中發(fā)育階段漫長，與榕樹互動(dòng)最為親密(Jansen-González and Sarmiento, 2008; Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014; Yangetal., 2012; Jiaetal., 2014; Yadav and Borges, 2018)，但由于榕小蜂個(gè)體小，生活隱蔽，對其幼期發(fā)育研究幾乎空白。為了解愛玉子榕小蜂與蟲癭之間的互作機(jī)制，本研究將探討：(1)愛玉子榕小蜂與蟲癭協(xié)同發(fā)育的動(dòng)態(tài)變化；(2)愛玉子榕小蜂在蟲癭內(nèi)的營養(yǎng)來源及位置變化；(3)愛玉子榕小蜂體長與蟲癭大小的發(fā)育相關(guān)性；(4)冬、夏季愛玉子榕小蜂發(fā)育歷期的差異。開辟昆蟲-植物互作研究的新視角，為進(jìn)一步揭示榕樹-榕小蜂協(xié)同進(jìn)化的內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

已被產(chǎn)卵的愛玉子雄果采集于福建省泉州市愛玉子種植園，雌、雄株一年均有2次花期。夏季樣品采集始于2018年4月10日，選定6棵愛玉子雄株，密切關(guān)注榕果發(fā)育狀態(tài)，4月20日對A期未進(jìn)蜂的榕果進(jìn)行套袋，防止小蜂和其他昆蟲進(jìn)入榕果內(nèi)。2018年5月10日通過放蜂獲得80個(gè)同期被產(chǎn)過卵的進(jìn)蜂榕果，此后每隔3～4 d采集3個(gè)進(jìn)蜂榕果帶回實(shí)驗(yàn)室備用，采樣每周兩次，直至2018年8月20日小蜂全部出飛結(jié)束。冬季樣品采集時(shí)間為2018年8月1日至2019年5月30日，8月15日通過套袋放蜂獲得150個(gè)同期進(jìn)蜂果。

1.2 蟲癭和傳粉榕小蜂發(fā)育的觀察和測量

縱向切開榕果，觀察蟲癭發(fā)育狀況，從單個(gè)榕果中隨機(jī)挑取30個(gè)蟲癭，在體視顯微鏡下(Nikon SMZ1500)用游標(biāo)卡尺測量蟲癭的長徑和短徑(圖1)，然后用解剖針對蟲癭進(jìn)行逐層解剖。使用生物顯微鏡(Olympus BX51)觀察蟲癭結(jié)構(gòu)、愛玉子榕小蜂發(fā)育狀態(tài)及其在蟲癭內(nèi)的位置，運(yùn)用景深擴(kuò)展軟件(Image-Pro Plus)和成像系統(tǒng)(SteREO Lumar V12)進(jìn)行拍照和測量。記錄蟲癭上小蜂交配孔和出飛孔的位置。榕小蜂發(fā)育歷期計(jì)算：參考王芳等(2016)的統(tǒng)計(jì)方法，以放蜂時(shí)間為小蜂發(fā)育起點(diǎn)，記錄小蜂的發(fā)育階段和日齡，根據(jù)日齡表得出各階段的發(fā)育歷期。記錄實(shí)驗(yàn)期間樣地每月的平均氣溫和平均降水量。

圖1 蟲癭形態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 蟲癭殼和瘦果果殼的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

選取幼蟲期各階段的蟲癭和成熟的瘦果樣品進(jìn)行固定，固定方法參見Jia等(2014)，再經(jīng)臨界點(diǎn)干燥后取出，用銅導(dǎo)電膠帶粘于樣品臺上，用離子濺射儀鍍膜，放入掃描電子顯微鏡的樣品箱進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0和EXCEL2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 幼期愛玉子榕小蜂與蟲癭協(xié)同發(fā)育過程

愛玉子榕小蜂的產(chǎn)卵針插入癭花花柱，產(chǎn)卵于花柱基部子房內(nèi)珠被與珠心間隙中(圖2: A)，癭花花柱被產(chǎn)卵后枯萎(圖2: B)。在產(chǎn)卵后的1-3 d(孵化期)，珠心組織的細(xì)胞迅速膨大，細(xì)胞液劇增，使原本緊實(shí)的珠心組織快速轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)薄壁組織。子房不對稱膨大，導(dǎo)致花柱位置下移至側(cè)方，扁圓形的子房轉(zhuǎn)變?yōu)殚L橢球形蟲癭(圖2: B)，同時(shí)，蟲癭柄也快速伸長。

愛玉子榕小蜂發(fā)育分為卵期、幼蟲期和蛹期，幼蟲分為5齡(蟲齡劃分另文發(fā)表)，無法分辨雌雄，幼蟲蟲體呈圓柱形，頭端大，尾端小，體表光滑，軀體柔軟，具13體節(jié)；1齡(圖2: C)、2齡(圖2: D)幼蟲蟲體直，3齡(圖2: E)、4齡(圖2: F)、5齡(圖2: G)幼蟲蟲體彎曲呈“C”型；1-3齡幼蟲蟲體白色半透明(圖2: C, D, E)，可看到中腸充滿了白色或黃色顆粒，4、5齡幼蟲的體壁肌肉組織發(fā)達(dá)，呈不透明的白色(圖2: F, G)。小蜂幼蟲停止取食后，排的蛹便，進(jìn)入預(yù)蛹階段(圖2: H)。蛹期分為3個(gè)階段：初期蛹(圖2: I, J)、中期蛹(圖2: K, L)和成熟蛹(圖2: M, N)，雌雄蛹異形分化，復(fù)眼最早呈現(xiàn)色彩，且雄蛹發(fā)育早于雌蛹1.34±0.27 d (n=236)。

圖2 幼期愛玉子榕小蜂和蟲癭的發(fā)育過程

幼蟲期小蜂營養(yǎng)由珠心分化而來的營養(yǎng)層供給。在小蜂1-3齡幼蟲期，營養(yǎng)層的細(xì)胞壁薄，細(xì)胞液含水量高(解剖蟲癭時(shí)，由于薄壁細(xì)胞被擠壓或切割造成細(xì)胞液外流，故通常觀察到幼蟲位于透明的營養(yǎng)層組織液中)。4齡幼蟲期蟲體與白色半透明粘膠狀營養(yǎng)層的顏色和狀態(tài)十分相似(圖2: F)，進(jìn)入5齡幼蟲期后營養(yǎng)層越發(fā)粘稠，呈半固態(tài)啫喱狀(圖2: G)。電子顯微鏡下，可見營養(yǎng)層表面存在球狀分泌顆粒，其直徑在小蜂1-3齡幼蟲期約10～50 μm(圖3: A)，在小蜂4-5齡幼蟲期約5-10 μm，且分泌顆粒在泌出后再次堆疊在一起(圖3: B)，推測可能是由于發(fā)育初期營養(yǎng)層的細(xì)胞液含水量高，易分泌，故分泌顆粒較大。由此推斷，榕小蜂幼蟲發(fā)育以營養(yǎng)層的分泌物為食。營養(yǎng)層在小蜂發(fā)育至5齡幼蟲末期(預(yù)蛹期)時(shí)消失(圖2: H)，蛹期的小蜂不再攝取食物。

圖3 蟲癭和瘦果結(jié)構(gòu)比較

蟲癭殼(圖3: C)由表皮層、保護(hù)層和內(nèi)皮層組成(圖3: D)，蟲癭表皮層由子房壁外層分化而來，幼蟲期白色透明，蛹期始顏色逐漸變黃，小蜂羽化時(shí)呈褐色。蟲癭內(nèi)皮層由珠被分化而來，隨著卵的孵化，珠心膨大，內(nèi)皮層變薄并緊貼于保護(hù)層。表皮層和內(nèi)皮層均膠質(zhì)化，富含水分，為小蜂提供良好的濕度保障。蟲癭保護(hù)層由子房壁內(nèi)層分化而來，由長管狀厚壁細(xì)胞(圖3: E, F)組成，細(xì)胞從蟲癭柄端向遠(yuǎn)柄端延伸，并在匯合處發(fā)生折疊(圖3: G)，因此，兩端保護(hù)層較厚，中部保護(hù)層較薄(圖3: C)。在小蜂1-2齡幼蟲期，蟲癭保護(hù)層厚壁化程度低，蟲癭殼透明(圖2: C, D)，保護(hù)層各個(gè)部位的厚度較一致(圖3: H)；進(jìn)入3齡幼蟲期，保護(hù)層細(xì)胞厚壁化明顯，癭殼透明度降低(圖2: E)，3齡幼蟲末期蟲癭體積已接近最大值；4齡幼蟲期后蟲癭殼呈不透明的米白色。保護(hù)層是癭殼的骨架，主要起保護(hù)作用，為小蜂提供相對獨(dú)立和安全的生存空間，并對非傳粉榕小蜂有一定的防御作用。

在電子顯微鏡下對蟲癭殼(圖3: C)和瘦果果殼(圖3: I)的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，結(jié)果表明：(1)二者雖然均為長橢圓形，但蟲癭較為渾圓，而瘦果細(xì)長；蟲癭長(3.21±0.23 mm,n=30)和寬(1.55±0.06 mm,n=30)均顯著大于瘦果的長(2.34±0.09 mm,n=30)和寬(0.89±0.11 mm，n=30)；蟲癭長寬比為2.07∶1，瘦果長寬比為2.62∶1，兩者存在顯著差異(P<0.05)。(2)與瘦果果殼(圖3: I)比較，蟲癭殼(圖3: C)保護(hù)層的厚度顯著增厚，尤其在端部約增厚2倍(P<0.05)。(3)營養(yǎng)層功能差異，只有蟲癭營養(yǎng)層具備向榕小蜂幼蟲輸送營養(yǎng)液的作用。綜上可見愛玉子榕小蜂的造癭作用，既改變了殼的形態(tài)，又改變了營養(yǎng)輸送功能。

2.2 幼期愛玉子榕小蜂在蟲癭內(nèi)的位置變化

愛玉子榕小蜂1、2齡幼蟲位于花柱基部(圖2: C, D)，3齡幼蟲遷移至蟲癭上側(cè)(圖2: E)，隨著小蜂發(fā)育，愈來愈大的蟲體由上側(cè)向下擴(kuò)展(圖2: F, G)。1-4齡幼蟲能蠕動(dòng)和翻轉(zhuǎn)，故蟲體的頭尾和背腹方向隨機(jī)，但5齡前中期幼蟲“C”型蟲體的頭尾在下(圖2: G)，而末期5齡幼蟲會發(fā)生“翻轉(zhuǎn)”，故預(yù)蛹頭尾在上，且占滿整個(gè)蟲癭(圖2: H)。蛹期中雌蛹的體位均“頭尾在上”(100%,n=235)(圖2: I, K, M)，而雄性蛹的體位多為“頭尾在上”(圖2: J, L, N)，少數(shù)“頭尾在下”(1.67%,n=120)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，97%的雌、雄愛玉子榕小蜂的出飛孔和81%的雄峰所打的交配在圖中所示位置(圖2: M, N，紅框所示位置)，蟲癭保護(hù)層在該位置較薄，便于鉆孔，也表明蟲癭內(nèi)部空間狹小，小蜂活動(dòng)范圍有限，小蜂在化蛹時(shí)就已確定好體位，便于羽化出飛。

2.3 愛玉子榕小蜂體長與蟲癭直徑的發(fā)育動(dòng)態(tài)

愛玉子榕小蜂幼蟲在1-4齡期生長速度較快，增長率為25.91 μm/d；5齡期生長較緩慢，增長率為6.26 μm/d；5齡末期幼蟲體長增長進(jìn)入平臺期；蛹期小蜂體長略有增加，但增幅不大(圖4)。在1-3 齡幼蟲期蟲癭快速膨大(1齡幼蟲期增幅尤其明顯)，在小蜂發(fā)育至4齡時(shí)，蟲癭直徑增長進(jìn)入平臺期，即蟲癭發(fā)育進(jìn)入平臺期的時(shí)間早于小蜂，為小蜂發(fā)育提供充足的生長空間。由于蟲癭長徑增長較快(長徑增長率為短徑的1.80倍，長徑增長率為26.43 μm/d，短徑增長率為14.67 μm/d，卵期的蟲癭為扁球形，隨小蜂發(fā)育至4齡初期，蟲癭變?yōu)殚L橢球形；蟲癭在小蜂羽化期可能由于蟲癭殼脫水，以及小蜂活動(dòng)，導(dǎo)致長徑稍縮短，而短徑稍增長(圖4)。

圖4 愛玉子榕小蜂體長與愛玉子上蟲癭直徑的發(fā)育動(dòng)態(tài)

2.4 夏季和冬季愛玉子榕小蜂發(fā)育歷期比較

在福建地區(qū)愛玉子榕小蜂一年2代，世代歷期明顯不同，夏季世代歷期(5月中旬-8月中旬)約112 d，幼蟲期約80 d；冬季世代歷期(8月中旬-翌年5月中旬)約253 d，幼蟲期約192 d。冬季各階段幼蟲的發(fā)育歷期均比夏季長，尤其是5齡幼蟲的發(fā)育歷期，冬季(91 d)比夏季(25 d)延長了66 d，小蜂以5齡幼蟲越冬，延長進(jìn)食期有利越冬。從圖5可知，在氣溫高、水分充足的夏季，愛玉子榕小蜂發(fā)育歷期較短；而在氣溫較低、水分較少的秋冬季，愛玉子榕小蜂發(fā)育歷期較長。

圖5 兩代愛玉子榕小蜂發(fā)育歷期及水熱條件比較

3 討論

3.1 榕小蜂幼蟲的攝食方式

關(guān)于榕小蜂幼蟲在榕果蟲癭內(nèi)的攝食方式，目前沒有直接的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，均是通過對幼蟲期榕小蜂蟲癭顯微解剖(Leclerc du Sablon, 1908; 姚若潔, 1998; Jiaetal., 2014)和組織切片的觀察結(jié)果(Jansen-Gonzálezetal., 2012, 2014)推測榕小蜂幼蟲依賴植物胚珠和胚乳組織存活，認(rèn)為榕小蜂孵化后進(jìn)入珠心組織中，直接攝食植物組織。但本研究根據(jù)對蟲癭結(jié)構(gòu)的電鏡觀察可知，蟲癭營養(yǎng)層向愛玉子榕小蜂生存的空間分泌球狀顆粒，愛玉子榕小蜂位于分泌液中；運(yùn)用4%多聚甲醛對蟲癭進(jìn)行固定，其結(jié)果也證明愛玉子榕小蜂幼蟲與營養(yǎng)層(即早期為珠心組織)一直都處于分離狀態(tài)。因此，我們推測：(1)榕小蜂孵化后并沒有進(jìn)入珠心組織中，而是依然位于珠心與珠被之間，避免傷害胚珠，讓被產(chǎn)卵的癭花子房仍能完成初期的發(fā)育(Verkerke, 1989)，同時(shí)也避免導(dǎo)致寄主植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)(嚴(yán)盈, 2008)。(2)建群蜂在產(chǎn)卵時(shí)將多肽、蛋白質(zhì)和其他化合物混合組成的產(chǎn)卵分泌物注入寄主植物的組織中(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)，導(dǎo)致珠心組織的細(xì)胞迅速膨大，細(xì)胞液劇增，使原本緊實(shí)的珠心組織快速轉(zhuǎn)化為柔軟營養(yǎng)薄壁組織，為幼蟲提供活動(dòng)空間，蟲癭切片顯示孵化后的榕小蜂位于珠心組織中(Jansen-González, 2012)，可能僅僅是幼蟲與珠心組織相對位置疊加產(chǎn)生的現(xiàn)象。(3)榕小蜂幼蟲并不是直接取食植物組織，而是吸食通過建群蜂產(chǎn)卵分泌物(Moreau and Guillot, 2005; Asgari and Rivers, 2011)和幼蟲攝食分泌物(Miles, 1999; 嚴(yán)盈等, 2008; 郭瑞等, 2012)刺激植物組織分泌的營養(yǎng)液。

有人認(rèn)為榕小蜂幼蟲從花柱基部遷移至蟲癭上側(cè)(遠(yuǎn)柄端胚乳所在位置)，與小蜂取食胚乳有關(guān)(Leclerc du Sablon, 1908; Verkerke, 1989; 姚若潔, 1998; Jansen-Gonzálezetal, 2008, 2012; Jiaetal., 2014)，但不以胚乳為食的重寄生肉食性非傳粉榕小蜂的幼蟲在3齡期也一樣移動(dòng)至遠(yuǎn)柄端(Galiletal., 1970; Eliasetal., 2012; Jansen-Gonzálezetal., 2014)，因此，我們推測小蜂幼蟲在蟲癭內(nèi)的位置變化并非由于幼蟲攝食胚乳所致，而是因?yàn)殚殴呐咧闉樾睊焓脚咧?，胚囊位于遠(yuǎn)柄端(Verkerke, 1989)，此處空隙較大，小蜂幼蟲選擇進(jìn)入結(jié)構(gòu)松散的區(qū)域，便于蟲體活動(dòng)。

3.2 影響榕小蜂發(fā)育歷期的因素

榕小蜂寄生于榕果中，因此寄主榕果發(fā)育期是影響小蜂發(fā)育歷期的首要因素。不同種類的榕樹，榕果發(fā)育周期明顯不同，如愛玉子榕果的發(fā)育周期長，一年結(jié)實(shí)2次，榕果的發(fā)育歷期3～10月，榕小蜂的發(fā)育期與寄主榕果的發(fā)育期同步，歷期亦長(吳文珊和陳友鈴, 2008)；細(xì)葉榕Ficusmicrocarpa榕果的發(fā)育周期短，單株一年結(jié)實(shí)1～4次，榕果發(fā)育歷期較短，其榕小蜂的發(fā)育期亦短(吳文珊等, 2013b)。在西雙版納，木瓜榕Ficusauriculata間花期約70 d，海南榕Ficushainanensis間花期約40 d，Yang等(2012)交換了木瓜榕和海南榕的傳粉榕小蜂之后，發(fā)現(xiàn)在木瓜榕中發(fā)育的海南榕傳粉榕小蜂Ceratosolensp.發(fā)育歷期增長，而在海南榕榕果中發(fā)育的木瓜榕傳粉榕小蜂Ceratosolenemarginatusy發(fā)育歷期縮短，表明寄主榕樹的繁殖特性決定小蜂發(fā)育歷期。

其次，繁殖地的水熱條件影響榕果發(fā)育歷期，從而影響小蜂發(fā)育歷期。即同一地區(qū)的同種榕樹在一年中不同的季節(jié)榕果發(fā)育期不同，小蜂發(fā)育歷期亦不同。例如，愛玉子榕果的發(fā)育期在水熱條件較好的夏季為3～4個(gè)月，而在秋冬季為8～10個(gè)月，其傳粉榕小蜂的發(fā)育歷期與果同步，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冬季愛玉子榕小蜂發(fā)育的各階段歷期均比夏季的長，尤其是5齡幼蟲期明顯延長，即延長了攝食期以應(yīng)越冬(圖5)。

榕小蜂發(fā)育歷期還與食物源相關(guān)，寄主相同的造癭蜂、重寄生蜂和寄居蜂，產(chǎn)卵時(shí)間不同(通常造癭蜂先產(chǎn)卵，重寄生蜂和寄居蜂后產(chǎn)卵)但出飛時(shí)間相近(Cruaudetal., 2013; Yadav and Borges, 2018)，表明植食性造癭蜂的發(fā)育歷期較長，而肉食性和植食性兼具的重寄生蜂和寄居蜂發(fā)育歷期較短，推測同源性食物有利于小蜂對營養(yǎng)成分的吸收。