大分舌蜂不同齡期幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌群落多樣性及其差異

寇若玫, 李 月, 竇飛越, 周澤揚(yáng), 黃敦元

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 媒介昆蟲重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 401331)

社會性群居蜜蜂中，工蜂腸道中核心微生物主要涉及到變形菌門(Proteobacteria)中的Snodgrassellaalvi和Gilliamellaapicola(Kwong and Moran, 2012)、厚壁菌門(Firmicutes)中的乳桿菌屬LactobacillusFirm-4和Firm-5(Babendreieretal., 2007; Martinsonetal., 2011)、放線菌門(Actinobacteria)中的Bifidobacteriumasteroides(Bottacinietal., 2012)5個(gè)物種分支。而在獨(dú)棲蜜蜂的相關(guān)研究表明腸道中同樣存在穩(wěn)定的核心菌群，包括：醋酸菌科(Acetobacteraceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)和草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)(Voulgari-Kokotaetal., 2019)。

蜜蜂腸道微生物與宿主多種生命活動息息相關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，腸道微生物在抑制微生物病原的定殖和入侵(Forsgren, 2010; Vásquezetal., 2012; Killeretal., 2014)、復(fù)雜碳水化合物的發(fā)酵和吸收以及重要營養(yǎng)物質(zhì)的合成等方面均起到重要作用(Martinsonetal., 2014)。在獨(dú)棲性野生蜜蜂共生菌群同樣有益于宿主的特定功能，Vuong等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿切葉蜂Megachilerotundata共生益生菌米氏乳桿菌Lactobacillusmicheneri對花粉消化、解毒以及病原抑制有一定功效(Vuongetal., 2019)；孔蜂Heriadestruncorum共生菌類芽孢桿菌PaenibacillusMBD-MB06具有抑制真菌入侵的作用(Kelleretal., 2018)；隧蜂Augochlorapura共生菌中含有大量乳桿菌屬Lactobacillus的益生菌群(McFredericketal., 2012)。

社會性蜜蜂的幼蟲通過工蜂喂養(yǎng)獲得共生微生物，其中腸道共生微生物占有較大比例(Powelletal., 2014)。在剛開始喂養(yǎng)期間，幼蟲腸道微生物會迅速增長(Kwong and Moran, 2016)，并且，隨著幼蟲的發(fā)育，腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化(Vojvodicetal., 2013)。獨(dú)棲野生蜜蜂的幼蟲在單獨(dú)的蟲室中發(fā)育，一般雌蜂將采集到的花粉和花蜜與唾液腺分泌物混合做成蜂糧放入蟲室中供幼蟲生長發(fā)育所需，雌蜂在蜂糧制作的過程定殖必要的有益菌群協(xié)助幼蟲對蜂糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化(Marthaetal., 1984)。前期研究還發(fā)現(xiàn)獨(dú)棲性野生蜜蜂的腸道微生物具有宿主特異性，并且環(huán)境因素可能在獨(dú)棲性野生蜜蜂蜂巢和宿主共生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化起著重要驅(qū)動作用(Gilliametal., 1990; McFredericketal., 2012, 2017; Kelleretal., 2013)。

大分舌蜂Collelesgigas屬膜翅目(Hymenoptera)分舌蜂科(Colletidae)分舌蜂屬Colletes，是一種土壤筑巢獨(dú)棲性野生蜜蜂類群。分舌蜂科是蜜蜂總科中比較原始的一個(gè)科，其中分舌蜂屬是分布最廣的一個(gè)屬，主要分布于中亞地區(qū)(趙延會等, 2010; Niuetal., 2014)。大分舌蜂蟲室內(nèi)有玻璃紙狀的膜包裹蜂糧，這種膜具有防水保濕的功能(趙延會等, 2010)。 雌性大分舌蜂主要訪問油茶Camelliaoleifera和茶樹Camelliasinensis等山茶屬植物，是屬典型寡食性獨(dú)棲野生蜜蜂，該蜂成蟲期與油茶花期高度吻合，是油茶傳粉的優(yōu)勢傳粉昆蟲(黃敦元等, 2014; Lietal., 2020)。然而，目前為止，還沒有關(guān)于大分舌蜂腸道微生物的報(bào)道(包括成蟲和幼蟲)，鑒于腸道微生物對宿主的重要生物學(xué)意義，以及獨(dú)棲蜜蜂幼蟲腸道微生物研究匱乏，本研究采用IlluminaMiSeq二代高通量測序方法，對大分舌蜂幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行了初探，比較了不同齡期幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性差異，并對腸道細(xì)菌的基因功能進(jìn)行預(yù)測。以期為后續(xù)此類野生蜜蜂的保護(hù)生物學(xué)研究提供科學(xué)基礎(chǔ)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹樣品采集

本實(shí)驗(yàn)所用大分舌蜂幼蟲樣本于2018年11月-2019年3月采集于江西省新余市渝水區(qū)水北鎮(zhèn)(28°04′N, 115°06′E)。參照已有文獻(xiàn)報(bào)道大分舌蜂巢穴生境(趙延會等, 2010)，尋找巢穴進(jìn)行挖掘與采集，將采集的完好蟲室分裝于滅菌處理的5 mL凍蟲管內(nèi)并及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后期處理，剝離大分舌蜂玻璃紙狀巢穴，將存活幼蟲按照1-5齡和滯育預(yù)蛹進(jìn)行區(qū)分(黃敦元等, 2015)。不同齡期幼蟲及滯育預(yù)蛹的解剖方式：70%酒精進(jìn)行蟲體體表消毒30 s, 0.1%的Triton-X 100溶液處理5 min，最后用超純水沖洗3次，然后于超凈工作臺中，在昆蟲Ringer’s溶液中解剖得到腸道樣品放入2 mL離心管(Limetal., 2015)。累計(jì)得到6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組5個(gè)重復(fù)樣品，每個(gè)樣品10頭幼蟲腸道材料。所有樣品經(jīng)液氮速凍，并及時(shí)存入-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.2 大分舌蜂幼蟲腸道細(xì)菌基因組DNA的提取

腸道細(xì)菌基因組DNA提取采用NucleoSpin? 96 Soil Kit(德國MACHEREY-NAGEL公司)，提取步驟按試劑盒的說明書。分離得到的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切下目的條帶測定，分光光度檢測A260/A280和A260/A230值。

1.3 16S rRNA基因片段擴(kuò)增，文庫構(gòu)建與測序

得到DNA產(chǎn)物利用細(xì)菌16S rRNA基因片段V3-V4區(qū)通用引物(338F: 5′-ACTCCTACGGGAGG CAGCA-3′； 806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)(Lietal., 2018)擴(kuò)增得到16S rRNA基因片段V3-V4區(qū)。結(jié)合條形碼和參考序列擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)。PCR反應(yīng)體系：DNA樣品60 ng， dNTPs(10 μmol/L)1 μL， High GC Enhancer 10 μL， Q5 DNA Polymerase with High-Fidelity 0.2 μL， Buffer 10 μL，上下游引物終濃度10 μmol/L。PCR擴(kuò)增條件： 95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性1 min， 50℃退火1 min， 72℃延伸1 min，15個(gè)循環(huán)； 72℃延伸7 min(Takebayashietal., 2000)。用VAHTSTM DNA Clean Beads純化第一步得到的PCR產(chǎn)物，隨后，在40 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)體系：第一步中PCR產(chǎn)物10 μL， 2×Phμsion HF MM 20 μL， ddH2O 8 μL，上下游引物終濃度10 μmol/L。反應(yīng)條件: 98℃預(yù)變性30 s； 98℃變性10 s， 65℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 10個(gè)循環(huán)； 72℃延伸5 min。最后，用Quant-iTTMdsDNA HS Reagent進(jìn)行定量，并將其整合到一起。最后，將整合純化得到的產(chǎn)物利用IlluminaHiseq PE250測序平臺進(jìn)行雙端測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

利用FLASH(version 1.2.11)軟件對雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接(Magoand Salzberg, 2011)；利用Trimmomatic(version 0.33)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾過后(Bolgeretal., 2014)，除去低于200 bp的序列和大于8 bp的同聚體；利用UCHIME Algorithm去除嵌合體序列，質(zhì)控獲得高質(zhì)量的clean reads。

利用QIIME V1.7.0(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)對同源性在97%水平上進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)聚類(Bokulichetal., 2013; Edgar, 2013)，并利用SILVA數(shù)據(jù)庫對得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行注釋(Quastetal., 2013)。通過RDP(Ribosomal Database Program)(V2.2)在不同分類級別進(jìn)行分類注釋(Wangetal., 2007)，并且利用OTUs數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行稀釋曲線的繪制，以驗(yàn)證數(shù)據(jù)的可靠性(Wangetal., 2012)。

基于注釋結(jié)果，利用Mothur (v.1.30)(Schlossetal., 2009)分析alpha多樣性(Shannon-Wiener, Simpson, ACE和Chao1指數(shù))；利用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析研究其組間是否存在顯著差異；利用GraphPad Prism 8進(jìn)行可視化?；赒IIME軟件聚類得到的OTU，利用Binary-Jaccard算法計(jì)算得到組間Beta距離，非度量多維標(biāo)定法(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)降維并進(jìn)行可視化(Looftetal., 2012)；最后，利用多元方差分析PERMANOVA(Adonis)計(jì)算組間是否存在顯著差異(利用R軟件)。利用線性判別分析效應(yīng)量[linear discriminant analysis (LDA) effect size, LEfSe]揭示出差異顯著且最有可能解釋細(xì)菌群落差異的分類特征(LDA>4.0)(Segataetal., 2011)?；诿總€(gè)OTU在Greengenes基因數(shù)據(jù)庫(http:∥greengenes.secondgenome.com/)中對應(yīng)的基因獲得COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)蛋白家族信息，利用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States)(Langille-Morganetal., 2013)比對測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，比對測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，利用R軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖繪制，利用SPSS進(jìn)行單因素方差分析以及多重比較。PICRUSt(http:∥greengenes.secondgenome.com/)和LEfSe(http:∥huttenhower.sph. harvard.edu/lefse/)分析都利用在線Galaxy workflow framework進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)測序和分類注釋

利用IlluminaMiSeq平臺對16S rRNA基因V3-V4區(qū)擴(kuò)增子雙端測序，共得到2 313 574個(gè)原始片段，經(jīng)過質(zhì)控優(yōu)化后得到2 203 686條有效序列(valid reads)，平均長度為410.13±3.50 bp(表1)。稀釋曲線顯示，隨著抽樣序列數(shù)量的增多，每組樣本所觀測到的物種數(shù)趨于平緩飽和，說明本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)具有可靠性(圖1)以及反應(yīng)數(shù)據(jù)的真實(shí)性。根據(jù)97%的序列相似度對所有序列進(jìn)行同源比對，共聚類得到192個(gè)OTU (表1)，并對結(jié)果進(jìn)行注釋得到15個(gè)門(注釋比例: 99.44%)，23個(gè)綱(注釋比例: 98.87%)，43個(gè)目(注釋比例: 98.87%)，80個(gè)科(注釋比例: 94.92%)，128個(gè)屬(注釋比例: 84.75%)(表2)。

表1 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌16S rRNA基因測序后過濾數(shù)據(jù)

圖1 大分舌蜂不同齡期幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌組成稀釋曲線

表2 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌不同分類級別已注釋的分類單元數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.2 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道主要細(xì)菌群落組成

從門水平上，主要的10種菌群包括：變形菌門(Proteobacteria)占93.74%(占細(xì)菌群落總數(shù)的比例；下同)，厚壁菌門(Firmicutes)占3.04%，梭桿菌門(Fusobacteria)占1.22%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占1.05%, 放線菌門(Actinobacteria)占0.71%，Epsilonbacteraeota占0.05%，酸桿菌門(Acidobacteria)占0.04%，Halanaerobiaeota占0.02%，疣微菌門(Verrucomicrobia)占0.01%，綠彎菌門(Chloroflexi)占0.01%。從目水平，主要的10種菌群包括立克次氏體目(Rickettsiales)占68.68%，腸桿菌目(Enterobacteriales)占19.17%，假單胞菌目(Pseudomonadales)占4.80%，梭菌目(Clostridiales)占1.42%，梭桿菌目(Fusobacteriales)占1.22%，擬桿菌目(Bacteroidales)占0.99%，乳桿菌目(Lactobacillales)占0.75%，根瘤菌目(Rhizobiales)占0.68%，丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)占0.43%，棒狀菌目(Corynebacteriales)占0.36%。從科水平，主要的10種菌群包括無形體科(Anaplasmataceae)占68.64%，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)占19.17%，莫拉氏菌科(Moraxellaceae)占4.78%，梭桿菌科(Fusobacteriaceae)占1.22%，毛螺菌科(Lachnospiraceae)占0.66%，根瘤菌科(Rhizobiaceae)占0.62%，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)占0.53%，乳桿菌科(Lactobacillaceae)占0.49%，消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)占0.44%，韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)占0.43%。從屬水平，主要的10種菌群包括：沃爾巴克氏體屬Wolbachia占68.64%，腸桿菌屬Enterobacter占18.18%，不動桿菌屬Acinetobacter占4.77%，梭桿菌屬Fusobacterium占1.22%，蒼白桿菌屬Ochrobactrum占0.61%，乳桿菌屬Lactobacillus占0.49%，擬桿菌屬Bacteroides占0.40%，Peptoclostridium占0.36%，泛菌屬Pantoea占0.36%，紅球菌屬Rhodococcus占0.35%。物種組成結(jié)果顯示，低齡組(1-3齡幼蟲)腸道細(xì)菌組成上相近，高齡組(4-5齡幼蟲)腸道細(xì)菌組成上相近，滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌組成上與其他齡期幼蟲的差異較大(圖2)。

圖2 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌在門(A)、目(B)、科(C)和屬(D)水平的相對豐度

2.3 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌群落多樣性

基于屬水平Alpha多樣性分析結(jié)果表明(圖3)：ACE與Chao1指數(shù)在低齡組(1-3齡幼蟲)、高齡組(4-5齡幼蟲)與滯育預(yù)蛹組之間不存在顯著差異。低齡組的Shannon-Wiener指數(shù)極顯著高于滯育預(yù)蛹組(P<0.001)，高齡組的Shannon-Wiener指數(shù)極顯著高于滯育預(yù)蛹組(P<0.01)，高齡組與低齡組Shannon-Wiener指數(shù)沒有顯著差異，總體上，低齡組到滯育預(yù)蛹組出現(xiàn)Shannon-Wiener指數(shù)從高到低的趨勢。低齡組的Simpson指數(shù)極顯著低于滯育預(yù)蛹組(P<0.001)，高齡組的Simpson指數(shù)極顯著低于滯育預(yù)蛹組(P<0.01)，高齡組與低齡組的Simpson指數(shù)沒有顯著差異(P>0.05)，總體上，低齡組到滯育預(yù)蛹組，出現(xiàn)Simpson指數(shù)從低到高的趨勢。

圖3 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌α多樣性指數(shù)差異分析

Beta多樣性分析結(jié)果表明，1-3齡幼蟲腸道細(xì)菌聚在一起，4和5齡幼蟲腸道細(xì)菌聚在一起，滯育預(yù)蛹期腸道細(xì)菌聚集在一起，顯示出低齡組、高齡組和滯育預(yù)蛹組3個(gè)水平(圖4)；進(jìn)一步對其組間距離進(jìn)行多元方差分析，結(jié)果顯示低齡組(YL)與高齡組(AL)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(R2=0.080,P=0.008)，高齡組(AL)與滯育預(yù)蛹組(CD)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較有顯著差異(R2=0.310,P=0.001)，滯育預(yù)蛹組(CD)和低齡組(YL)腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較有顯著差異(R2=0.291,P=0.001)，顯示大分舌蜂幼蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化調(diào)節(jié)過程可分為低齡組、高齡組和滯育預(yù)蛹組。

圖4 利用非度量多維尺度法(NMDS)對大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌進(jìn)行Beta多樣性分析

2.4 大分舌蜂不同階段幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道菌群差異

線性判別分析(LDA)效應(yīng)量(LEfSe)分析結(jié)果顯示(圖5)，滯育預(yù)蛹組(CD)與低齡組(YL)都存在顯著優(yōu)勢的菌群，而高齡組(AL)不存在顯著優(yōu)勢菌群。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)為低齡組優(yōu)勢綱，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)為滯育預(yù)蛹組優(yōu)勢綱；在目水平，腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)為低齡組優(yōu)勢目，立克次氏體目(Rickettsiales)為滯育預(yù)蛹組優(yōu)勢目；在科水平，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和莫拉菌科(Moraxellaceae)為低齡組優(yōu)勢科，無形體科(Anaplasmataceae)為滯育預(yù)蛹組優(yōu)勢科；在屬水平，腸桿菌屬Enterobacter和不動桿菌屬Acinetobacter為低齡組優(yōu)勢屬，沃爾巴克氏菌屬Wolbachia為滯育預(yù)蛹組優(yōu)勢屬。

圖5 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌LEfSe分析

2.5 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道菌群基因功能預(yù)測

利用COG數(shù)據(jù)庫對大分舌蜂幼蟲腸道菌群進(jìn)行基因功能預(yù)測，進(jìn)一步聚類分析發(fā)現(xiàn)，低齡組(YL)和高齡組(AL)聚在一個(gè)分支而滯育預(yù)蛹組(CD)為單獨(dú)一分支(圖6)。同源族分析結(jié)果顯示，注釋到的功能包括三大類：信息儲存與處理(information storage and processing)(占25.02%)， 新陳代謝(metabolism)(占38.77%)，細(xì)胞生理過程與信號(cellular physiological processes and signaling)(占21.02%)。低齡組新陳代謝和細(xì)胞生理過程與信號相關(guān)功能基因比例顯著高于滯育預(yù)蛹組的(P<0.05)，滯育預(yù)蛹組信息儲存與處理相關(guān)功能基因比例顯著高于低齡組(P<0.01)和高齡組的(P<0.05)(圖7)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，滯育預(yù)蛹組腸道菌群在細(xì)胞生理過程與信號相關(guān)功能基因大類中的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸(intracellular trafficking, secretion and vesicular transport)，翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、伴侶(posttranslational modification, protein turnover, chaperones)和細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分配(cell cycle control, cell division, chromosome partitioning)相關(guān)基因顯著高于低齡組與高齡組的。滯育預(yù)蛹組腸道菌群在信息儲存與處理相關(guān)功能基因大類中的復(fù)制、重組和修復(fù)(replication, recombination and repair)以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(translation, ribosomal structure and biogenesis)相關(guān)基因顯著高于低齡組與高齡組的。

圖6 大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹腸道細(xì)菌基因功能COG注釋及聚類分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)了大分舌蜂幼蟲腸道細(xì)菌與之前獨(dú)棲蜜蜂腸道核心菌群(Voulgari-Kokotaetal., 2019)相似的一些共生菌群，例如腸桿菌科、莫拉菌科、毛螺菌科和乳桿菌科。大分舌蜂幼蟲腸道細(xì)菌群落中，變形菌門占據(jù)最主要地位，這個(gè)門的細(xì)菌在社會性蜜蜂中也比較常見。在A.melliferajemenitica中，腸道細(xì)菌主要的3個(gè)門為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門(Andersonetal., 2015)；另外在日本東方蜜蜂Apisceranajaponica共生細(xì)菌研究中也發(fā)現(xiàn)變形菌門的存在(McFredericketal., 2017)。但本研究厚壁菌門只占整個(gè)菌群的很小比例。另外，在屬分類水平上，沃爾巴克氏菌Wolbachia是大分舌蜂幼蟲腸道共生細(xì)菌中的最主要的屬，同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些獨(dú)有的腸道共生細(xì)菌，這些細(xì)菌的存在可能與宿主特異性，以及環(huán)境食物來源相關(guān)。大分舌蜂具有典型的寡食性，其主要訪花山茶屬的植物(油茶占主要地位)，蟲室具有玻璃紙狀的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與土壤筑巢的特點(diǎn)(趙延會等, 2010; 黃敦元等, 2015)，腸道共生菌群可能受到山茶屬植物與土壤共生菌群的影響，然而，其中是否具有相關(guān)性以及影響程度還有待通過其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

Beta多樣性分析結(jié)果顯示，大分舌蜂在低齡幼蟲(1-3齡)、高齡幼蟲(4-5齡)和滯育預(yù)蛹不同階段腸道共生細(xì)菌的組成結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了顯著變化；Alpha多樣性分析顯示，隨著幼蟲生長階段的遞進(jìn)，其腸道微生物的多樣性出現(xiàn)逐步降低的現(xiàn)象(圖3)。相反，群居社會性蜜蜂幼蟲從低齡到高齡的發(fā)育過程中，其腸道細(xì)菌多樣性表現(xiàn)出逐步升高的趨勢(Kwong and Moran, 2016)，這一現(xiàn)象可能與幼蟲生長過程中進(jìn)食息息相關(guān)。前期的行為學(xué)研究顯示，大分舌蜂低齡幼蟲期(1-3齡)進(jìn)食相對緩慢，高齡幼蟲期(4-5齡)開始大量進(jìn)食，直到食物耗盡停止進(jìn)食，便進(jìn)入滯育預(yù)蛹，這一點(diǎn)可能與其進(jìn)食特點(diǎn)具有相關(guān)性。另一方面，大分舌蜂整個(gè)幼蟲期的食物都來源于成蜂提前備好的蜂糧，并且整個(gè)周期都存活于相對封閉、穩(wěn)定的玻璃紙狀巢室中(黃敦元等, 2015)，這與群居蜜蜂幼蟲通過成蜂喂養(yǎng)攝取食物的口器喂養(yǎng)行為有明顯的不同，因此，其變化趨勢或許也與腸道微生物驅(qū)動對相對穩(wěn)定環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。前期研究表明，動物腸道菌群對不同類型食物脅迫下引起的腸道環(huán)境變化存在逐漸適應(yīng)的特征(Tiloccaetal., 2017)。但這種隨著齡期增加，其腸道細(xì)菌多樣性降低的現(xiàn)象以及其如何對腸道環(huán)境逐步適應(yīng)這一過程還有待進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)一步對大分舌蜂低齡幼蟲、高齡幼蟲和滯育預(yù)蛹3個(gè)階段腸道細(xì)菌之間的差異進(jìn)行分析，以找到不同階段出現(xiàn)顯著變化的物種，這些物種的顯著變化與存在可能為不同階段大分舌蜂幼蟲宿主提供著重要的生物學(xué)意義。沃爾巴克氏菌屬是本研究結(jié)果中占比最多的一個(gè)屬，并且，它在滯育預(yù)蛹組占比更為顯著。作為一種廣泛存在于昆蟲體內(nèi)的共生菌群，其功能是多樣的。沃爾巴克氏體的一個(gè)關(guān)鍵特征是它能在無脊椎動物體內(nèi)生存并操縱細(xì)胞和生殖過程(Werrenetal., 2008)。其表型效應(yīng)和宿主相互作用主要表現(xiàn)為：一是對精子產(chǎn)生修飾作用從而導(dǎo)致精卵細(xì)胞胞質(zhì)不親和(cytoplasmic incompatibility, CI)，最后造成胚胎的早期死亡(Poinsotetal., 2003)；其次是通過多種方式引起宿主孤雌生殖，例如：作用于細(xì)胞減數(shù)第一次分裂，導(dǎo)致中期染色體未分離而造成純合二倍體核的形成，誘導(dǎo)孤雌生殖(parthenogensis induction)(Weeks and Breeuwer, 2001)；三是通過在雄性激素腺體內(nèi)增殖而影響其功能造成宿主雌性化(feminization)(Vandekerckhoveetal., 2003)以及影響宿主繁殖力(周淑香等, 2009)等多種作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克氏菌屬在溫帶臭蟲Cimexlectularius生存和繁衍中是必不可少的，它在宿主中起著營養(yǎng)互惠(nutritional mutualism)的作用(Hosokawaetal., 2010)；此外，沃爾巴克氏菌屬在抑制病原中也存在有利作用，例如可以誘導(dǎo)宿主對病原產(chǎn)生抗性，并且之前的研究顯示，其顯著降低RNA病毒感染造成的黑腹果蠅Drosophilamelanogaster死亡(Hedgesetal., 2008; Teixeiraetal., 2008)。Walker等(2011)的研究顯示，沃爾巴克氏菌屬可以阻斷登革熱2型(DENV-2)在埃及伊蚊Aedesaegypti中的傳播。在低齡組(1-3齡幼蟲)有兩個(gè)屬顯示出優(yōu)勢，包括腸桿菌屬Enterobacter和不動桿菌屬Acinetobacter(圖5)。 盡管，目前對于腸桿菌屬Enterobacter的研究中，未表明它是一種益生菌群(Al-Ghamdietal., 2017)，但這一菌群卻在蜜蜂腸道中有所發(fā)現(xiàn)(Martinsonetal., 2011)，并且在A.melliferajemenitica中被分離得到(Khanetal., 2017)。不動桿菌屬Acinetobacter由于具有多樣性的代謝功能而廣泛存在于各種環(huán)境中，同樣也在蜜蜂腸道中被分離得到過，例如蜂屬不動桿菌A.apis和蜜源不動桿菌A.nectaris(Kimetal., 2014)，其中蜜源不動桿菌是一種常見花和蜜蜂的共生微生物(álvarez-Pérezetal., 2013)。然而，目前為止，這一細(xì)菌群的成員對寄主的有利功能還未見報(bào)道，因此仍有待研究。上述結(jié)果表明，大分舌蜂幼蟲不同發(fā)育階段存在不同的優(yōu)勢菌群，其可能在不同發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用，但其中具有特定功能的菌株還有待進(jìn)一步分析以及實(shí)驗(yàn)證明。

通過PICRUSt對低齡組、高齡組以及滯育預(yù)蛹組腸道共生菌基因功能COG預(yù)測。聚類熱圖顯示，低齡組與高齡組聚在一個(gè)分支，而滯育預(yù)蛹組單獨(dú)為一個(gè)分支(圖6)。表明低齡組與高齡組幼蟲腸道細(xì)菌基因功能更為相近，而滯育預(yù)蛹組與發(fā)育階段腸道細(xì)菌(低齡組與高齡組)在基因功能上較遠(yuǎn)。這也進(jìn)一步從基因功能角度揭示大分舌蜂幼蟲及滯育預(yù)蛹具有的3個(gè)發(fā)育階段(低齡幼蟲、高齡幼蟲以及滯育預(yù)蛹階段)的特點(diǎn)(黃敦元等, 2015)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，低齡組新陳代謝和細(xì)胞生理過程與信號相關(guān)功能基因比例顯著高于滯育預(yù)蛹組；滯育預(yù)蛹組信息儲存與處理相關(guān)功能基因比例顯著高于低齡和高齡組(圖7)。低齡與高齡幼蟲都處于不斷進(jìn)食的生長期，對于剛開始進(jìn)食的低齡幼蟲來講，新陳代謝與細(xì)胞生理過程與處理相關(guān)功能基因的顯著存在有助于宿主對食物營養(yǎng)利用以及宿主的生長；而滯育預(yù)蛹處于停止進(jìn)食并且表現(xiàn)為形態(tài)變化停頓的時(shí)期，信號儲存與處理相關(guān)功能基因的顯著存在有助于宿主在沒有食物來源的情況下維持存活。進(jìn)一步分析顯示，滯育預(yù)蛹期腸道菌群在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡運(yùn)輸，翻譯后修飾、蛋白轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白，細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分配，復(fù)制、重組和修復(fù)以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生等相關(guān)功能基因都顯著高于低齡組與高齡組。綜上，結(jié)果表明，在大分舌蜂幼蟲不同發(fā)育階段中，其腸道菌群可能發(fā)揮著不同功能。然而，基于16S rRNA基因片段的PICRUSt分析并不能完全說明其中真正存在的功能，因此，這些功能是否與大分舌蜂幼蟲的生長發(fā)育存在直接相關(guān)性以及腸道細(xì)菌是否在其生長發(fā)育中發(fā)揮著具體作用還有待通過宏基因組學(xué)或其他技術(shù)手段進(jìn)一步研究。