飼料銅水平對赤眼鱒幼魚生長性能、體組成和成活率的影響

楊 凱，王岳松，高銀愛，楊慧君，袁勇超，成為為，魏輝杰，王青云

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水動(dòng)物養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

銅是脊椎動(dòng)物包括魚類的必需微量元素，具有多種生理功能，主要作為某些酶的輔助因子，如細(xì)胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶、賴氨酸氧化酶、多巴胺羥化酶和酪氨酸酶［1］。魚類飼料必須包括能量來源、必需氨基酸、必需脂肪酸、特定維生素和礦物質(zhì)，以維持生命和促進(jìn)生長［2］。部分魚類對銅的需求量已經(jīng)被定量化，如鯉魚和虹鱒魚［3］、斑點(diǎn)叉尾鮰［4］、奧尼羅非魚［5］、石斑魚［6］、黃顙魚［7］和藍(lán)點(diǎn)石斑［8］。現(xiàn)已有研究表明，飼料中缺乏銅會(huì)降低魚的食欲、生長速度、肝臟Cu-Zn SOD和心臟細(xì)胞色素氧化酶的活性［4-6，8，9］。且以往的研究也表明，魚類飼料中過量的銅會(huì)導(dǎo)致中毒綜合征［5］，包括生長減緩［10］、腸道嚴(yán)重?fù)p傷［11］以及提高腸道細(xì)胞增殖率和凋亡率［12，13］。在飼料中添加銅既要滿足銅的需要，又要避免銅中毒［14］。因其肉質(zhì)鮮美，且可接受配合飼料并快速生長的特性，赤眼鱒成為中國淡水養(yǎng)殖的一個(gè)很好的候選品種［15］。近年來，赤眼鱒最佳的飼料蛋白質(zhì)和脂肪水平已被確定［16］。然而到目前為止，還沒有關(guān)于其飼料銅需要量的定論。因此，本研究旨在探究赤眼鱒幼魚對飼料中銅的適宜需求量，并評估飼料銅水平對其生長性能和體組成的影響，以期補(bǔ)充完善赤眼鱒營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，為開發(fā)赤眼鱒不同生長階段專用飼料提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備

基礎(chǔ)飼糧（對照組飼糧）組成及營養(yǎng)水平［17］見表1。酪蛋白（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、魚油、豆油和糊精（武漢高龍飼料有限公司）分別作為飼糧的蛋白質(zhì)源、脂肪源和糖源。在基礎(chǔ)飼糧中不添加銅作為對照（干物質(zhì)基礎(chǔ)含銅0.29 mg/kg）［16］。另外8種試驗(yàn)處理飼料以CuSO4·5H2O（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）作為銅源的半純化飼糧中實(shí)際銅含量分別為0.29、1.31、2.28、3.43、4.57、6.61、8.77、10.73和12.89 mg/kg。制作飼料時(shí)，先將稱取各干料攪拌混合后加入蒸餾水混合，倒入制粒機(jī)（F-26（II），華南理工大學(xué)）磨制成顆粒狀，在45℃的通風(fēng)烘箱中烘干12 h。干燥后將其篩分出直徑1.0 mm的顆粒飼料，密封后在-20℃儲(chǔ)存。先用高氯酸消化后，再用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES，VIS?TA-MPX，VARIAN）對飼糧中的銅水平進(jìn)行分析。在所有飼糧中添加30 g/kg的誘食劑，其與魷魚外套膜組織具有類似化學(xué)組成可以增加飼糧適口性［18］。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)魚購自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地。在飼養(yǎng)試驗(yàn)開始前，先將赤眼鱒幼魚放置于1 600 L室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖水箱中馴化2周。馴化期內(nèi)，每天8：00和16：00分別投喂對照飼糧兩次。飼養(yǎng)試驗(yàn)共分9組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚。選取810尾健康狀況良好、體型均勻的魚（初始體重為6.22±0.11 g）放置在27個(gè)砂濾曝氣后的淡水水箱（300 L）中，每箱放30尾魚。每天分別在8：00和16：00給魚投喂試驗(yàn)飼料至飽食，記錄每日進(jìn)料情況，為避免糞便污染，于投料后40 min收集未吃飼料并記錄重量，每天檢查死亡情況。飼養(yǎng)試驗(yàn)期間維持12 h光照、12 h黑暗，水溫25.6～27.4℃，溶氧量6.7 mg/L，pH 7.4～8.1，總氨氮0.033～0.057 mg/L，定期檢測飼養(yǎng)水中銅含量（1.36±0.41μg/L），養(yǎng)殖周期為8周。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，對每個(gè)水箱中魚體稱重并進(jìn)行組織取樣分析。每個(gè)水箱中選8尾魚用三卡因甲烷磺酸鹽（MS-222）麻醉，解剖5尾魚肝臟，并集中分析。肝臟保存在-80℃，用于測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu-Zn SOD）活性。

1.4 指標(biāo)測定及分析

采用標(biāo)準(zhǔn)程序［16］對飼糧中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和灰分進(jìn)行測定。將肝組織勻漿到9倍體積的冷緩沖液（0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%生理鹽水，pH 7.4）中，4℃下3 000 r/min離心15 min，保存上清液以測定Cu-Zn SOD的活性和MDA的含量。采用BCATM蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定蛋白含量，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物測試盒（南京建成生物工程研究所）測定丙二醛（MDA）含量。采用ELISA標(biāo)準(zhǔn)方法測定金屬硫蛋白含量［18］。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的Cu-Zn SOD活性測定試劑盒（A001-2）按照說明書測定Cu-Zn SOD活性。用分光光度法測定血清蛋白質(zhì)濃度［19］。所有分析測定進(jìn)行3次重復(fù)。

1.5 生長指標(biāo)計(jì)算

存活率（SR，%）=100（Nf/Ni），其中，Nf為試驗(yàn)?zāi)┢隰~成活數(shù)，Ni為試驗(yàn)初期魚成活數(shù)；增重率（WG，%）=100［（Wf-Wi）/Wi］，其中，Wf為末期魚體重，Wi為試驗(yàn)初期魚體重；特定生長率（SGR，%/d）=100（lnWf-lnWi）/T，其中，Wf試驗(yàn)?zāi)┢隰~體重，Wi為試驗(yàn)初期魚體重，T為試驗(yàn)周期；飼料系數(shù)（FCR）=WF/（Wf-Wi），其中，WF為攝食量；蛋白質(zhì)效率（PER，%）=（Wf-Wi）/WF×Wp，其中，Wp為飼料中蛋白質(zhì)含量；全體銅蓄積量（μg）=（Cf-Ci，μg）-（CF，μg）［5］，其中，Cf為試驗(yàn)?zāi)┢隰~全體銅含量，Ci為試驗(yàn)初期魚全體銅含量，CF為銅攝入量；肥滿度（CF，%）=100Wf/L3，其中，L為魚體長；肝體比（HSI，%）=100（WH/W），其中，WH為肝臟重；臟體比（VSI，%）=100（WV/W），其中，WV為內(nèi)臟重。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。通過單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)各數(shù)據(jù)之間的方差和顯著差異，若差異性顯著采用鄧肯氏多重比較檢驗(yàn)P＜0.05顯著性水平的均值。對試驗(yàn)魚全體銅蓄積量進(jìn)行二次曲線回歸分析，對WG和FCR進(jìn)行線性回歸分析以評估赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的需要量。

2 結(jié)果與分析

喂食對照飼糧（0.29 mg/kg飼料銅組）的試驗(yàn)魚出現(xiàn)典型的飼糧銅缺乏癥狀，如生長不良和骨骼畸形。各試驗(yàn)飼糧飼養(yǎng)下魚的生長性能、形態(tài)指標(biāo)和存活情況如表2所示。飼喂對照飼糧的試驗(yàn)魚的SGR明顯低于飼喂其他飼糧的魚。4.57 mg/kg飼料銅組的魚SGR最高（1.68%/d），但在低銅水平和高銅水平時(shí)均有下降（P＜0.05）。PER與SGR的變化趨勢相似。相反，飼糧銅水平為0.29 mg/kg時(shí)，F(xiàn)CR最低。通過線性回歸模型分析，可以很好地表現(xiàn)飼糧中銅水平與WG之間的關(guān)系，赤眼鱒生長性能最佳飼糧銅水平為4.79 mg/kg（圖1）。對試驗(yàn)魚的FCR進(jìn)行折線回歸分析表明，飼糧中銅的適宜需要量為4.92 mg/kg（圖2）。飼喂對照飼糧的試驗(yàn)魚SR低于飼喂銅水平≤10.73 mg/kg飼糧的魚。飼糧銅水平對VSI和HSI有顯著影響（P＜0.05，表2），對CF卻沒有顯著影響（P＞0.05）。

表2 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚生長性能、形態(tài)指標(biāo)和存活情況的影響

圖1 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚增重的影響

圖2 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚飼料系數(shù)的影響

由表3可以看出，飼糧銅水平也顯著影響赤眼鱒的體組成（P＜0.05）。其體脂肪含量隨飼糧銅水平的升高而降低（P＜0.05）。隨著飼糧銅水平的增加，全體銅蓄積量顯著增加（P＜0.05）（表4）。對全體銅蓄積量和飼糧銅水平進(jìn)行線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)飼糧中銅的適宜需求量為3.94 mg/kg（圖3）。

圖3 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚全體銅蓄積量的影響

表3 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚體組成和銅含量的影響

表4 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚全體銅蓄積量的影響

肝臟銅濃度隨飼糧銅水平的增加而顯著（P＜0.05）增加（表5）。飼糧銅水平對赤眼鱒肝臟中TBARS濃度有顯著影響（P＜0.05）。各組中，飼喂對照日糧的魚的TBARS值最高（表5）。飼糧銅水平對肝臟Cu-Zn SOD活性有顯著影響（P＜0.05），低銅含量飼糧和高銅含量飼糧對肝臟Cu-Zn SOD活性的影響顯著（P＜0.05）低于3.43 mg/kg飼糧和4.57 mg/kg飼糧。

表5 飼糧銅水平對赤眼鱒幼魚肝臟Cu-Zn SOD活性、TBARS值和銅濃度的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明飼糧中銅水平對赤眼鱒幼魚的生長性能有顯著影響，以4.57 mg/kg飼料銅組飼糧飼養(yǎng)的試驗(yàn)魚SGR最高。在石斑魚和黃顙魚中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果［7，20］。飼養(yǎng)魚類時(shí)飼糧銅缺乏或過量都會(huì)生長緩慢，這與其他水生動(dòng)物一致［21，22］。對照組魚體FCR和PER值最低，但與12.89 mg/kg飼料銅組魚體FCR和PER值無顯著性差異。同樣，較低或較高的飼糧銅水平會(huì)影響黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的生長和飼料利用［7，23］。有研究表明，飼糧銅缺乏會(huì)抑制羅非魚和石斑魚的食欲和生長［5，6］，而魚體內(nèi)銅含量過高會(huì)導(dǎo)致中毒綜合征［11，13］，包括生長減緩［10］、腸道細(xì)胞增殖和代謝的微妙變化［12，13］以及腸道的嚴(yán)重?fù)p傷［11］。因此，在魚飼料中補(bǔ)充銅是滿足銅需求和避免銅毒性之間的平衡［14］。

對WG進(jìn)行折線回歸分析，赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的最佳需求量為4.79 mg/kg。以生長和生化指標(biāo)作為評價(jià)指標(biāo)，赤眼鱒飼糧銅需求量與有鰭魚相似（3～6 mg/kg）［4-6，23，24］。魚類對銅的最適需要量與魚種、攝食方式和生長階段有關(guān)［10］。通過對試驗(yàn)魚FCR進(jìn)行折線回歸分析，赤眼鱒幼魚對飼糧中銅的最佳需求量為4.92 mg/kg。

在本研究中不論是攝入不足或過量銅的赤眼鱒幼魚，其VSI和HSI均顯著降低。Wu等［22］報(bào)道，當(dāng)飼糧銅水平≥12.22 mg/kg時(shí)甲魚肝臟出現(xiàn)縮小，HSI顯著降低，清楚地證明了該濃度下的銅水平會(huì)對甲魚產(chǎn)生不利影響。但關(guān)于魚和蝦的報(bào)道顯示其肝臟銅含量和HSI呈正相關(guān)［21，25］。在本研究中VSI和HSI的降低可能是由于這些組攝食減少或機(jī)體為解毒和維持體內(nèi)平衡而增強(qiáng)代謝所致。

隨著飼糧銅水平的增加，試驗(yàn)魚全體銅蓄積量顯著下降，這種現(xiàn)象在其他研究中也有報(bào)道［5-6，25］。肝臟是魚類主要的銅儲(chǔ)存器官［24，26］。在本研究中飼糧中銅含量顯著影響了赤眼鱒的體組成。脂肪、蛋白質(zhì)和銅的組織沉積依賴于飼料攝入量、代謝利用和腸道吸收，而這些因素都可能受到飼糧中銅水平升高的影響［27］。Handy等［28］提出與食用11 mg/kg銅水平的干性飼料的魚相比，食用500 mg/kg銅水平的干性飼料1個(gè)月后，虹鱒魚的脂肪儲(chǔ)存顯著下降。本研究中赤眼鱒全體和肝臟銅蓄積量隨飼糧中銅水平的增加而增加，表明赤眼鱒可能在組織中積累過量的銅。一般來說，當(dāng)魚被喂食高濃度銅7 d或更長時(shí)間后，高濃度銅會(huì)在腸組織、肝臟和膽囊積聚，而在鰓、肌肉和腎臟積聚的銅濃度較低［29-31］。

SOD作為一種抗氧化酶，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷方面發(fā)揮著重要作用［32，33］。SOD是一種銅依賴酶，已經(jīng)被證明是一個(gè)很好的研究大鼠和貓銅營養(yǎng)需求的評價(jià)指標(biāo)［34，35］。Gatlin等［4］也報(bào)道了喂養(yǎng)0～2.0 mg/kg銅水平飼料的斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟中Cu-Zn SOD活性明顯低于喂養(yǎng)4 mg/kg銅水平飼料的斑點(diǎn)叉尾鮰。本研究結(jié)果表明飼糧中低劑量銅（≤2.28 mg/kg）和高劑量銅（≥6.61 mg/kg）都會(huì)降低赤眼鱒肝臟Cu-Zn SOD活性。TBARS是通過檢測脂質(zhì)氧化來評價(jià)氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)之一［36］。肝臟TBARS值與肝臟Cu-Zn SOD活性呈負(fù)相關(guān)。飼糧中低劑量銅和高劑量銅都會(huì)升高試驗(yàn)魚肝臟TBARS值，可能是由于Cu-Zn SOD活性較低所致。

通過對試驗(yàn)魚WG、FCR線性回歸分析和魚體銅蓄積量的二次曲線回歸分析，赤眼鱒幼魚的最適飼糧銅需求量為3.94～4.92 mg/kg。飼糧中銅的缺乏或過量都會(huì)顯著降低赤眼鱒幼魚的生長速度和攝食量。飼糧中的銅會(huì)使赤眼鱒幼魚肝臟蓄積銅，并表現(xiàn)出毒性作用。