二氧化碳氣腹環(huán)境對裸鼠卵巢癌移植瘤中Beclin1表達的研究*

楊 冬，王麗峰，張 穎，溫都蘇

1.廉江市人民醫(yī)院婦科，廣東 廉江 524400；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 湛江 524023

腹腔鏡手術(shù)因其獨特的開腹手術(shù)不可比擬的優(yōu)點，在婦科手術(shù)領域得到廣泛的開展，并逐漸成為主流方式。隨著手術(shù)醫(yī)生操作技巧的不斷提高、腹腔鏡手術(shù)器械的日益改善，避免術(shù)后因手術(shù)原因造成的癌癥術(shù)后轉(zhuǎn)移成為研究熱點。CO2氣腹進入視野，部分報道認為CO2氣腹可能引發(fā)惡性腫瘤的種植性［1］。CO2氣腹通過直接的細胞外環(huán)境的缺氧及血流動力學方面的影響導致了腹腔內(nèi)缺血、腹腔局部缺氧［2］。依據(jù)Hanly等［3］的研究結(jié)果腹膜局部微環(huán)境的改變源于腹膜對CO2氣體的吸收、腹膜局部免疫力的下降。Nordgren等［4］認為，腫瘤耐受缺氧環(huán)境得以繁殖是其存活的根本。部分專家、學者認為，以CO2為氣腹介質(zhì)的腹腔鏡通過煙霧化作用、煙囪效應、腫瘤細胞的穿刺孔直接污染等增加盆腹腔惡性腫瘤在腫瘤細胞腹腔內(nèi)侵襲、轉(zhuǎn)移的風險［5-9］，相應的增加卵巢癌的轉(zhuǎn)移風險［10］。本次試驗以裸鼠卵巢癌移植瘤為研究對象，對照標本中自噬基因Beclin1在CO2氣腹作用后的變化情況探討對癌細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤標本的獲得：將SPF等級BALB／c／nu裸小鼠40只（雌性，7～8周齡），恒溫飼養(yǎng)，人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV3（購自中國科學院上海生命科學研究細胞庫），細胞培養(yǎng)后接種于裸鼠，要求每個裸鼠接種細胞數(shù)量一致，飼養(yǎng)成瘤后成瘤。隨機分四組：（1）對照組：10只雌性裸鼠鼠；（2）開腹組：10只雌性裸鼠開腹手術(shù)維持30 min；（3）氣腹0.5 h組：10只雌性裸鼠氣腹維持30 min；（4）氣腹0.5 h組：10只雌性裸鼠氣腹維持30 min。集體處死，收集各組中裸鼠腹腔內(nèi)生長的移植瘤標本，取標本甲醛固定及80℃冰箱。

1.1.2 主要實驗器材：液氮罐、電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、Western blot曝光系統(tǒng)、Eppendorf 5417R冷凍離心機、XW-80A旋渦混合器、凝膠成像分析系統(tǒng)UVPM-20、逆轉(zhuǎn)錄PCR儀（Mastercycler gradient）、雙目生物顯微鏡Nikon YS100。

1.1.3 主要試劑：（1）實時熒光定量PCR相關(guān)試劑：Total RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應試劑盒、Beclin1 PCR引物、無水乙醇、氯仿、DEPC（焦碳酸二乙酯）、異丙醇、瓊脂糖等。（2）免疫組化相關(guān)試劑：兔抗人Beclin1單克隆抗體（美國Abcam公司）、二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、中性樹膠、蘇木素等均購置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檸檬酸二鈉、PBS、檸檬酸、二甲苯等。（3）Western blot主要試劑：兔抗人Beclin1單克隆抗體（美國Abcam公司）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、組織裂解液、Bradford蛋白定量試劑盒、蛋白Marker、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（BeyoECL Plus）、1.0M Tris-Hcl（PH6.8）、1.5M Tris-Hcl（PH8.8）、5×蛋白上樣緩沖液、N-N亞甲基雙丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、SDS、丙烯酰胺、TEMED、甘氨酸等。

1.2 實驗方法

圖1 裸鼠卵巢癌組織中的RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2（上）融曲線；（下）融解峰

圖3 擴增曲線

1.2.2 免疫組化：（1）試驗操作 對40例標本石蠟固定后行二步法免疫組化檢測，一抗選擇Beclin1（美Abcam公司1:2 000稀釋）。（2）免疫組化結(jié)果判斷標準Beclin1相應蛋白陽性表達定位于細胞漿中，可被染成淺黃色、棕黃色或是棕褐色。取每張切片中表染色最強的部分，按著色程度進行評分。0分：基本未著色，染色與背景相似；1分：著色淺，染色略高于背景；2分：中度著色，明顯高于背景；3分：強染，染成深棕黃色。每張切片隨機選取5個200倍鏡視野，根據(jù)陽性細胞所占比例進行評分，陽性細胞數(shù)小于5%者為0，陽性細胞數(shù)5%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4分。將以上兩種評分相加，積分為0～1分，表示陰性（“—”）；積分為2～3分，表示弱陽性（+）：積分為4～5分，表示中陽性（++）；積分為6～7分，表示強陽性（+++）。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）：各組分別提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，制備上樣，PAGE電泳膠制備根據(jù)Beclin1、GAPDH蛋白的分子量（52 kDa、36 kDa）分別選用8%和12%的分離膠和5%的聚丙烯酰胺凝膠（濃縮膠），電泳、轉(zhuǎn)模、免疫印跡。結(jié)果采用用AlphaView軟件進行灰度值分析，以內(nèi)參GAPDH的灰度值為標準，目的蛋白所得的灰度值與內(nèi)參灰度值相比得出相對灰度值，繪制圖表。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

Beclin1 mRNA在對照組、開腹組、CO2氣腹0.5 h組及CO2氣腹1 h組裸鼠卵巢癌移植瘤組織中表達呈遞減趨勢，且在CO2氣腹1 h組下降最為明顯（圖4）。四組進行單因素方差分析，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。對照組與開腹組、CO2氣腹0.5 h組與CO2氣腹1 h組組間兩兩比較，無統(tǒng)計學差異，而CO2氣腹0.5 h或氣腹1 h組與對照組或開腹組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

圖4 Beclin1在四組組織中的相對表達量比較

表1 Beclin1在四組組織中的相對表達量及組間比較結(jié)果

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 HE染色：從40例標本中各取1張石蠟切片進行HE染色，確定所取標本均為卵巢癌組織（圖5）。

圖5 HE染色（20×）

2.2.2 Beclin1在裸鼠卵巢癌組織中的表達情況：Beclin1在四組裸鼠卵巢癌移植瘤組織中的表達情況見表2、圖6。由于各組間陽性表達率差異不明顯，本實驗選擇評分進行統(tǒng)計學分析。從表中可以看出，Beclin1在四組組織中的陽性表達率無明顯差別，表達強度評分雖有逐漸下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 A:陰性對照（PBS代替一抗）；B：弱陽性表達；C：中陽性表達；D：強陽性表達（20×）

表2 Beclin1蛋白在裸鼠卵巢癌移植瘤組織中的表達情況

2.3 Western blot結(jié)果

Beclin1在四組組織中的表達呈逐漸降低，在CO2氣腹1 h組下降尤為明顯（見圖7），單因素方差分析顯示四組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對照組、開腹組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；CO2氣腹0.5 h組與CO2氣腹1 h組比較無統(tǒng)計學差異（P＜0.05）而CO2氣腹0.5 h或氣腹1 h組與對照組或開腹組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果一致，見表3。

表3 Beclin1相應蛋白在四組組織中的相對表達量及組間比較結(jié)果

圖7 Beclin1相應蛋白在四組組織中的相對表達

3 討論

CO2氣腹對術(shù)后癌癥轉(zhuǎn)移及再發(fā)癌癥的影響提上日程，體外研究發(fā)現(xiàn)，CO2氣腹通過上調(diào)或下調(diào)細胞因子CXCLl2、CXCR4、nm23-H1、MMP-2、VEGF、VEGFR-2等促進卵巢癌的轉(zhuǎn)移［11-13］。而女性生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生（諸如乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌）中，自噬作為細胞保護機制的缺陷可導致上述腫瘤的發(fā)生。癌基因或抑癌基因通過自噬途徑改變其活性。CO2氣腹的體外模擬環(huán)境下自噬的改變對卵巢癌的轉(zhuǎn)移是否促進目前正在進一步的研究當中。部分研究表明，高壓力CO2氣腹產(chǎn)生的機械性壓迫和代謝影響呼吸、循環(huán)、消化、神經(jīng)內(nèi)分泌等，同時氣腹壓力的增加可導致腫瘤的種植性轉(zhuǎn)移。

作為自噬的啟動蛋白越來越多的證據(jù)表明，Beclin1表達可能是自噬的“守門人”。Beclin1通過激活PI3K III/Vps34通路以介導自噬的正性調(diào)節(jié)，是調(diào)控自噬的一個必需的基因。在人乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中觀察到高頻率的Beclin1等位基因的缺失。Liang等［14］的研究表明乳腺癌組織中Beclin1呈低表達或無表達，在人乳腺癌細胞系MCF-7中，Beclin1表達下降，并幾乎檢測不到。在對卵巢癌的研究中，Laudanski等［15］收集的卵巢癌標本中Beclin1的表達較良性腫瘤中的表達下調(diào)。Qu等［16］發(fā)現(xiàn)，40%～70%的卵巢癌中有自噬相關(guān)基因Beclin1缺失。免疫組化對比研究顯示：Beclin1在上皮性卵巢癌中的表達明顯低于良性卵巢腫瘤組織和鄰近非腫瘤組織段振玲［17］、Shen［18］，同時研究顯示其表達水平與卵巢癌的分化程度、組織學分型、FIGO分期呈負相關(guān)。

本實驗的研究中僅就模擬腹腔鏡下的缺血缺氧環(huán)境表達其對Beclin1的影響。本實驗中：（1）Beclin1在CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組的表達量與對照組及相比較差異有統(tǒng)計學意義，因多項研究表明Beclin1屬抑癌基因，其表達下調(diào)說明腫瘤在CO2氣體處理后增殖能力加強。（2）CO2氣腹0.5 h組、CO2氣腹1 h組中Beclin1的表達兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明CO2氣腹對腫瘤的增殖的影響在Beclin1介導的自噬途徑上無明顯時間差異性。故CO2氣體可通過Beclin1的表達來促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。CO2氣體造成的缺氧環(huán)境可抑制Beclin1的表達，使Beclin1表達降低。

本實驗通過檢測裸鼠建立的人卵巢癌移植瘤動物模型中自噬相關(guān)基因Beclin1的表達情況，并對比CO2氣腹作用后Beclin1的表達差異來反應CO2氣腹作用后卵巢癌細胞的增殖情況，初步評估CO2氣腹通過自噬途徑對卵巢癌細胞生長的影響。依據(jù)研究結(jié)果，本實驗認為，CO2氣腹可能通過影響B(tài)eclin1的表達進而影響自噬的發(fā)生，通過下調(diào)Beclin1的表達促進卵巢癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移，這種影響與CO2氣腹作用時間無明顯直接聯(lián)系。

研究缺血、缺氧機制僅作為腹腔鏡手術(shù)的一部分為臨床手術(shù)應用提供實驗依據(jù)，但是否可以通過相應條件的阻斷仍需不斷的研究。其最終目的在于通過不斷研究和改進為腹腔鏡手術(shù)能夠很好地服務于卵巢癌患者提供相關(guān)依據(jù)及減低術(shù)后轉(zhuǎn)移的風險。