超高壓輔助提取藍靛果花青素工藝優(yōu)化

李圣橈，李若萌，陳博樸，張 衛(wèi)，周亞軍

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130062）

吉林省長白山地區(qū)藍靛果資源豐富、價格低廉，果實中含有大量的維C、氨基酸及黃酮類物質(zhì)，提取物中花青素含量較高。其可被加工成藍靛果飲料、果醬等產(chǎn)品銷售，但因其味苦澀使其難以被接受，且加工中產(chǎn)生的皮渣被當(dāng)作廢棄物扔掉，造成資源浪費。花青素（Anthocyanidin）是一種存在于植物中的水溶性色素，具有抗氧化活性、抗病毒和防治心血管疾病等功能[1]，可以幫助食品著色，對糖尿病等多種疾病的防治都有著顯著成效[2]。

長期以來，花青素的提取工藝較多采用傳統(tǒng)溶劑浸提法，但由于其存在提取時間長、提取率低、操作復(fù)雜等問題，難以滿足當(dāng)今工業(yè)化需求。為尋求較為高效、快捷的提取方法，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量研究，并在超聲波[3]、微波[4]、高壓脈沖電場[5]等物理手段輔助提取法方面取得了一定的進展，但仍存在成本高、對提取物有破壞性等問題，因此未達到理想的提取效果。超高壓輔助提取技術(shù)（Ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是以水或其他流體為媒介，將處理樣品在100 MPa以上壓力下保持一段時間，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞、目標(biāo)產(chǎn)物得以充分釋放的一種新型提取技術(shù)[6]。李鵬等人[7]利用超高壓輔助提取桑葚花色苷并對其抗氧化活性研究。楊孝輝等人[8]利用超高壓提取不同植物中的多糖。葉陳麗等人[9]利用超高壓技術(shù)提取金銀花中的綠原酸，但超高壓輔助提取藍靛果中花青素未見報道。采用超高壓輔助提取藍靛果中的花青素，并優(yōu)化其工藝參數(shù)。以期為藍靛果深加工開辟新途徑，為花青素的高效提取提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果，吉林省延吉市二道白河鎮(zhèn)長白工坊生態(tài)產(chǎn)品有限公司提供?；瘜W(xué)試劑：鹽酸、氯化鉀、冰醋酸，分析純；無水乙醇（食品級），均為北京化工廠提供。

1.2 儀器與試劑

BCD-180TMP型冷藏冷凍冰箱，海爾公司產(chǎn)品；PHSJ-4F型pH計，上海禹昂自動化科技公司產(chǎn)品；HPP600MPa/40L型超高壓食品處理裝置，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TU-1800型紫外分光光度計，上海元析儀器公司產(chǎn)品；PTF-A+200型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H2-16KR型高速冷凍離心機，湖南長沙可成儀器設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；YTLG-10A型真空冷凍干燥機，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，蘇州威爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；THC-100型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海容威儀器有限公司產(chǎn)品；XL-02A型手提式粉碎機，杭州旭眾機械設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 超高壓輔助提取工藝流程

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

（1）藍靛果粉末制備。將藍靛果通過凍干機干燥后粉碎成粉末、1 mm過篩，密封后置于干燥環(huán)境中貯藏備用。

（2）超高壓處理。取藍靛果粉末樣品于燒杯中，根據(jù)乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比加入乙醇溶液，對其進行均質(zhì)得到更均勻的樣品液。改變壓力和保壓時間等設(shè)備參數(shù)對樣品液進行處理[10]。

（3）離心。提取液放入高速冷凍離心機內(nèi)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心12 min。

（4）測定吸光度。取上清液，分別用pH值4.5和1.0的緩沖溶液稀釋、搖勻，用蒸餾水作對照，于35℃下恒溫水浴30 min，于最大波長和700 nm處分別測其吸光度。

1.4 花青素含量檢測方法

花青素含量用pH值示差法檢測，通過紫外分光光度法計算求值，計算公式（1）。

式中：A-(A512-A700nm)pH1.0-(A512-A700nm)pH4.5；

Mw——分子量，449 g/mol；

V——提取液總?cè)莘e，mL；

n——樣品稀釋倍數(shù)；

ε——消光系數(shù)，26 900 L·mol-·1cm-1；

b——光程數(shù)，1 cm；

m——原料的質(zhì)量，g。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 預(yù)試驗及傳統(tǒng)溶劑浸提工藝優(yōu)化

對傳統(tǒng)溶劑提取法及超高壓提取法提取花青素進行預(yù)試驗，剔除無關(guān)變量，為進一步試驗做準(zhǔn)備。通過研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間4個因素對傳統(tǒng)溶劑浸提法提取花青素含量的影響，并通過正交試驗得出最佳工藝參數(shù)。

1.5.2 超高壓輔助提取花青素單因素試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，選壓力、保壓時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)這3個因素進行超高壓輔助提取花青素單因素試驗，研究其對花青素提取量的影響。

超高壓提取花青素因素與水平設(shè)計見表1。

表1 超高壓提取花青素因素與水平設(shè)計

1.5.3 超高壓輔助提取花青素響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對花青素提取量影響顯著的壓強（X）1、保壓時間（X）2、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X）33個因素進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，優(yōu)化出超高壓輔助提取花青素工藝的最佳參數(shù)。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗變量與編碼見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗變量與編碼

1.5.4 對比試驗

將超高壓輔助提取法與傳統(tǒng)溶劑浸提法最佳提取工藝參數(shù)與最大提取量進行對比分析，確定提取方法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結(jié)果為重復(fù)測定3次的平均值，用Origin 9.1和SPSS 20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行Anova和Duncan多重比較統(tǒng)計分析，用Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

取制備的含花青素提取液，置于紫外分光光度計中進行190～900 nm全波長掃描。

藍靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖見圖1。

由圖1可知，掃描光譜曲線呈平滑拋物線狀，最大波峰為512 nm，故確定512 nm為花青素的最大吸收波長。

圖1 藍靛果花青素提取液光譜掃描曲線圖

2.2 壓強對花青素提取量的影響

在料液比1∶30，保壓時間3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，研究壓強對花青素提取量的影響。

壓強對花青素提取量的影響見圖2。

圖2 壓強對花青素提取量的影響

由圖2可知，壓強低于250 MPa時，增大壓強，花青素提取量顯著提高（p＜0.05）；壓強達到250 MPa，增大壓強，提取量顯著降低（p＜0.05）。譚佳琪等人[10]提取桑葚花色苷時也觀察到了相似趨勢。其原因可能是一定壓力值會使細(xì)胞器、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受損，細(xì)胞滲透能力增加，有利于提取溶劑進入細(xì)胞，促進藍靛果中有效成分滲透到細(xì)胞外，提高花青素的提取率[11]。因此，最佳作用壓強選250 MPa。

2.3 保壓時間對花青素提取量的影響

在壓強250 MPa，料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%的條件下，研究保壓時間對花青素提取量的影響。

保壓時間對花青素提取量的影響見圖3。

圖3 保壓時間對花青素提取量的影響

由圖3可知，在保壓時間小于3 min時，花青素提取量隨保壓時間的增加而顯著增加（p＜0.05），當(dāng)保壓時間達到3 min后，增大保壓時間花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。與杜月嬌等人[12]在提取山葡萄花青素試驗結(jié)果趨勢一致。因為藍靛果細(xì)胞隨著保壓時間延長而破裂，目標(biāo)成分被提取出來，但時間過長會促進酶促反應(yīng)進行，導(dǎo)致花青素降解，使提取率降低。因此，最佳保壓時間選3 min。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響

在壓強250 MPa，料液比1∶30，保壓時間3 min的條件下，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花青素提取量的影響

由圖4可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～40%時，花青素提取量顯著增大（p＜0.05），并于乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時達到最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)達到40%后，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，花青素提取量顯著降低（p＜0.05）。王鑫等人[13]利用超高壓提取藍莓花青素得到了類似的結(jié)果。原因可能是花青素屬于黃酮類物質(zhì)，在乙醇中的溶解性較好，隨著其體積分?jǐn)?shù)增大，花青素溶出率增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過大后，使溶液極性降低，花青素溶解性隨之降低且易發(fā)生醇降現(xiàn)象，不利于花青素的提取。因此，乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)選為40%。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

花青素提取量Y與壓強（X）1、保壓時間（X）2和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X）33個因素的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

2.6 回歸模型建立及方差分析

對表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得響應(yīng)變量與響應(yīng)值間的二次回歸方程：

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

二次回歸模型的方差分析見表4。

由表4可知，數(shù)學(xué)模型F=36.79，p＜0.000 1，說明回歸模型極為顯著；失擬項F=0.755 2＞0.05，說明方程擬合良好；決定系數(shù)R2=0.979 4，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.952 6，說明響應(yīng)值與自變量間線性關(guān)系顯著，模型可信度較高。該模型可用于解釋花青素提取量的變化。

表4 二次回歸模型的方差分析

2.7 響應(yīng)面分析

通過軟件Design Expert 8.0.6分析得壓強與保壓時間、壓強與乙醇體積分?jǐn)?shù)、保壓時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用。

保壓時間與壓強交互作用及等高線圖見圖6，乙醇體積分?jǐn)?shù)與壓強交互作用及等高線圖見圖7，乙醇體積分?jǐn)?shù)與保壓時間交互作用及等高線圖見圖8。

由圖6可知，響應(yīng)曲面較陡，表明花青素提取量受二因素影響顯著；二者軸向等高線分布均勻，呈橢圓狀，交互作用較強。由圖7可知，響應(yīng)曲面較陡，花青素提取量受兩因素影響顯著；等高線呈橢圓狀，二者交互作用較強。由圖8可知，響應(yīng)曲面較陡，花青素提取量受二因素影響較大；二者軸向等高線呈橢圓狀并均勻分布，二者交互作用顯著。但是，由方差分析可知，壓強和保壓時間、壓強和乙醇體積分?jǐn)?shù)、保壓時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用均對花青素含量的影響并不顯著。

圖6 保壓時間與壓強交互作用及等高線圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與壓強交互作用及等高線圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)與保壓時間交互作用及等高線圖

2.8 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果及驗證

超高壓提取藍靛果花青素最佳工藝為壓強260.5 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33.1%，此時花青素提取量理論最大值為36.31 mg/g?？紤]實際操作，對工藝適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整后工藝為壓強250 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33%，該參數(shù)重復(fù)3次取平均值，得花青素提取量為36.15 mg/g，與預(yù)測值接近。模型能用于預(yù)測花青素提取量。

2.9 對比試驗分析

將超高壓輔助提取法和傳統(tǒng)溶劑浸提法最優(yōu)工藝參數(shù)與最大提取量進行對比。

超高壓提取與傳統(tǒng)溶劑提取花青素的對比見表5。

表5 超高壓提取與傳統(tǒng)溶劑提取花青素的對比

由表5可知，相較于傳統(tǒng)溶劑浸提法，超高壓輔助提取耗時少、操作簡便，且花青素提取量提高了44.3%。綜合考慮實際操作、提取效果和成本，超高壓電場輔助提取法能高效提取藍靛果花青素。

3 結(jié)論

單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗確定藍靛果花青素超高壓提取工藝最佳參數(shù)為壓強260.5 MPa，保壓時間3.5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)33.1%，花青素最大提取量為36.31 mg/g。與傳統(tǒng)溶劑浸提法相比，超高壓輔助提取顯著節(jié)省提取時間，節(jié)約了乙醇用量，花青素提取量提高了44.3%，是一種比較理想的天然產(chǎn)物提取方法。研究為超高壓技術(shù)在生物質(zhì)中有效成分的高效提取提供理論支持和借鑒參考。