常壓室溫等離子誘變選育微生物的研究進(jìn)展

徐禮生，于巧玲，張興桃，蔣變玲，李婷婷

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州234000）

0 引言

常壓室溫等離子體誘變（ARTP）是在常壓室溫下產(chǎn)生高濃度均勻等離子體射流，這種射流與細(xì)胞作用明顯，產(chǎn)生高密度高活性均勻粒子，誘變所需溫度低。與傳統(tǒng)的物理誘變技術(shù)相較具有明顯優(yōu)勢(shì)，所以在工業(yè)生產(chǎn)中常被使用[1-2]。ARTP通過(guò)高活性粒子可改變微生物核苷酸結(jié)構(gòu)進(jìn)而誘變得到目的細(xì)胞產(chǎn)物，使突變株具有良好穩(wěn)定性，無(wú)需真空裝置，操作簡(jiǎn)單[3]。雖然，化學(xué)誘變?cè)趩为?dú)和復(fù)合作用較為明顯，但在化學(xué)誘變應(yīng)用過(guò)程中易引起的環(huán)境污染問(wèn)題。ARTP系統(tǒng)DNA損傷大，突變率高于化學(xué)誘變和紫外線誘變。在ARTP系統(tǒng)中以氦氣作為主要?dú)怏w，不會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)[4-5]。

1 ARTP在細(xì)菌誘變方面的應(yīng)用

ATRP技術(shù)誘變產(chǎn)生枯草芽孢桿菌，通過(guò)以不產(chǎn)生脂肽作為篩選標(biāo)記得到高產(chǎn)菌株[6]。常壓室溫等離子誘變脫氮假單胞菌，將目的基因進(jìn)行擴(kuò)增導(dǎo)入脫氮假單胞菌，通過(guò)ARTP誘變處理產(chǎn)生高效高產(chǎn)的維B12產(chǎn)生菌，通過(guò)高通量篩選出高產(chǎn)菌株[7]。袁紅梅等人[8]通過(guò)ARTP誘變枯草芽孢桿菌使其產(chǎn)生大量腺苷，腺苷產(chǎn)生菌對(duì)于ARTP特別敏感，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩得到高產(chǎn)腺苷高產(chǎn)菌。利用ARTP選育微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株茂源鏈霉菌，通過(guò)其誘變致死率和突變率計(jì)算，高通量篩選和復(fù)篩選育出目的菌種進(jìn)行培育[9-10]。利用氦作為工作氣體的大氣等離子體（ARTP）處理新金分枝桿菌方法，突變體中新奧金菌被認(rèn)為是工業(yè)應(yīng)用最佳菌株[11]。ATRP技術(shù)對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行誘變，通過(guò)單因素試驗(yàn)，以及溶鈣圈法和酸度測(cè)定等測(cè)試方法選育出產(chǎn)酸量高且發(fā)酵穩(wěn)定乳酸菌菌株，不僅操作簡(jiǎn)便，同時(shí)節(jié)約成本[12]。ARTP通過(guò)高密度的粒子流，可與生物大分子作用改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生突變（堿基的缺失替換等）并且結(jié)合不同的篩選方法選育所需菌株。研究枯草芽孢桿菌BS120，對(duì)其進(jìn)行ARTP等離子誘變處理，以8-氮寡霉素和鳥(niǎo)嘌呤作為篩選拮抗物篩選遺傳穩(wěn)定且核黃素產(chǎn)量高的菌株[13-14]。ARTP等離子誘變紅霉素產(chǎn)生菌紅色多糖多孢菌，結(jié)合紫外進(jìn)行復(fù)合誘變，使菌株平均發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌提高了25.2%[15]。常壓室溫等離子體-紫外復(fù)合誘變育β-法尼烯高產(chǎn)菌株大腸桿菌，通過(guò)復(fù)合誘變進(jìn)一步提高了正突變株的突變率，正突變率提高43.3%[16]。常壓室溫等離子誘變技術(shù)可有效地通過(guò)高密度的活性粒子與生物大分子作用，或者通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而改變遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，達(dá)到誘變育種目的[17]。

2 ARTP在真菌誘變方面的應(yīng)用

常壓室溫等離子誘變技術(shù)在真菌方面也具有重大應(yīng)用價(jià)值，該技術(shù)在黑曲霉菌、米曲霉菌、紅曲菌等真菌誘變育種應(yīng)用廣泛[1]。研究單寧酶高產(chǎn)菌株黑曲霉，ARTP可快速誘變黑曲霉，通過(guò)固態(tài)搖瓶發(fā)酵和液態(tài)搖瓶發(fā)酵，得出菌株酶活性是出發(fā)菌株的1.64倍。由此得出，在最佳時(shí)間、溫度、單寧酸濃度、葡萄糖濃度在經(jīng)過(guò)ARTP誘變處理的黑曲霉菌株產(chǎn)單寧酶效率顯著提高[18]。曲酸是微生物有氧發(fā)酵具有抑制酪氨酸酶作用的有機(jī)酸，可作為食品防腐劑、美白劑或保鮮保色劑等。通過(guò)ARTP技術(shù)對(duì)米曲霉進(jìn)行誘變處理，再通過(guò)96孔板高通量篩選得到了曲酸產(chǎn)量穩(wěn)定的米曲霉菌株，較出發(fā)菌株曲酸產(chǎn)量增加31.48%[19]。紅曲菌是產(chǎn)橙和黃色素的一種真菌，可以作為食品生產(chǎn)中的著色劑。通過(guò)物理誘變紫外超聲波和化學(xué)誘變硫酸二乙酯，氯化鋰誘變紅曲菌。但是，這2種方法突變率低，成本高且后者對(duì)環(huán)境有污染，通過(guò)利用ARTP技術(shù)，選擇高產(chǎn)菌M1代培養(yǎng)，經(jīng)18代傳代培養(yǎng)，色素吸收光譜圖顯示橙，黃色素較出發(fā)菌有明顯增加[20]。研究高產(chǎn)木糖醇產(chǎn)生菌酵母念珠菌，通過(guò)ARTP技術(shù)突變得到200多個(gè)突變菌株，選育出產(chǎn)量最高T13[21]。對(duì)桑黃原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP等離子誘變，黃酮產(chǎn)生量提高86.7%，進(jìn)而證明ARTP干預(yù)了桑黃菌體內(nèi)產(chǎn)生黃酮化合物的代謝過(guò)程[2]。

3 ARTP在酵母誘變方面的應(yīng)用

常壓室溫等離子誘變技術(shù)在絲孢酵母、釀酒酵母和粘紅酵母等方面的應(yīng)用。利用ARTP誘變技術(shù)誘變絲孢酵母，對(duì)其遺傳物質(zhì)產(chǎn)生損傷，引起細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)產(chǎn)生錯(cuò)配位點(diǎn)，通過(guò)96孔板結(jié)合對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯高通量篩選，獲得具有穩(wěn)定遺傳菌株[22]。通過(guò)等離子射流對(duì)酒釀酵母單細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，選擇致死率為90%～95%反復(fù)誘變，最終篩選出了1株比出發(fā)菌RNA產(chǎn)量提高了39%的遺傳穩(wěn)定突變株[23]。通過(guò)從酵母菌中選育一株相對(duì)最高產(chǎn)的菌株進(jìn)行ARTP處理，將其RNA的含量提高了160.54%[24]。研究產(chǎn)生油脂的粘紅酵母，通過(guò)在120 W常壓室溫等離子誘變30 s，粘紅酵母的基因序列受到破壞，經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化使其產(chǎn)脂量提高17.59%[25]。

4 ARTP在微藻誘變方面的應(yīng)用

ARTP等離子誘變技術(shù)在微藻方面也具有普遍應(yīng)用。研究ARTP等離子誘變對(duì)螺旋藻氨基酸含量的影響，經(jīng)過(guò)ARTP等離子誘變技術(shù)選育出的螺旋藻突變菌株[26]。通過(guò)對(duì)油脂富含豐富的湛江等鞭金藻進(jìn)行ARTP等離子誘變處理，得到了較原始菌株高產(chǎn)油脂的突變菌株，且可穩(wěn)定遺傳[27]。蝦青素是一種具有強(qiáng)氧化力的類胡蘿卜素，具有延緩衰老、美白、提高人體自身抵抗力、抗癌的優(yōu)點(diǎn)。吳曉英等人[28]通過(guò)ARTP技術(shù)在100 W的輸出功率，氣體流速10 L/min下處理40 S破壞其遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，通過(guò)蝦青素合成抑制劑作為篩選劑，篩選出高產(chǎn)蝦青素比出發(fā)菌提高了52.96%的突變株。利用ARTP等離子誘變技術(shù)，經(jīng)過(guò)選育得到最高產(chǎn)量較出發(fā)菌提高了33.85%的菌株，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證該菌具有誘變作用且遺傳穩(wěn)定。

5 結(jié)語(yǔ)

常壓室溫等離子誘變技術(shù)是通過(guò)其高密度的高活性粒子流，破壞細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的基因序列發(fā)生破裂，引發(fā)修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)許多突變序列位點(diǎn)，再控制合適的輸出功率和時(shí)間等條件，可使出發(fā)菌株快速突變出現(xiàn)較高致死率，選育高產(chǎn)菌株。ARTP技術(shù)在微生物育種方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，大大提高微生物在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用效果。