超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取絞股藍(lán)總黃酮工藝研究

玉 瀾， 龍海華， 唐 森，2， 謝濟運， 張 鵬，2*

（1.廣西科技師范學(xué)院食品與生化工程學(xué)院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學(xué)院特色瑤藥資源研究與開發(fā)重點實驗室，廣西來賓546199；3.廣西科技師范學(xué)院實驗實訓(xùn)中心，廣西來賓546199）

絞股藍(lán)又名天堂草、七葉膽、五葉參和七葉參等，在廣西來賓金秀縣有廣泛的分布（常拓等，2019；鮑鳳霞等，2018）。因其具有健胃、消炎、抑菌、殺菌等作用，成為當(dāng)?shù)噩幾迦嗣駨V泛使用的中藥材，也可用作動物飼料添加劑。研究表明，絞股藍(lán)植物中主要化學(xué)成分包括皂苷、多糖、維生素、無機元素和黃酮類化合物等，其中活性成分黃酮類化合物與動物的內(nèi)分泌、脂質(zhì)代謝及抗氧化有著密切關(guān)系，在促進(jìn)動物生產(chǎn)性能及提高免疫力等方面起著重要作用（王廣慧等，2020；王瑞等，2014）。因此，絞股藍(lán)具有巨大的研究和開發(fā)潛力。

目前，提取總黃酮的方法有傳統(tǒng)回流提取、微波輔助提取和酶法輔助提取等。傳統(tǒng)回流提取耗時長，雜質(zhì)多；微波輔助提取溫度高，溶劑損失大，影響試驗結(jié)果；酶法提取需要使用專一性的酶，價格貴，提取成本高（裴煒等，2014）。為提高提取效果，本試驗采取一種新型的液-液萃取分離技術(shù)——雙水相萃取，雙水相萃取是兩種聚合物在適當(dāng)?shù)臐舛?、溫度下混合在一起形成的一種高效綠色生物分離技術(shù)，具有傳質(zhì)快、分相時間短、選擇性高和萃取條件溫和等優(yōu)勢，能除去大量可溶性雜質(zhì)，且對人體無害（辜鵬，2008）。本研究采用的乙醇-硫酸銨雙水相體系，具有低廉、低度、體系簡單及后續(xù)處理容易等優(yōu)點（張喜峰等，2013）。同時采用超聲輔助提取，利于細(xì)胞中的成分進(jìn)入溶劑中，加速細(xì)胞成分與溶劑的相互滲透和溶解，從而提高黃酮類化合物在溶劑中的溶解速度（曹小燕等，2019）。本研究為高效提取天然藥用植物中的黃酮類化合物提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 絞股藍(lán)，古都養(yǎng)生堂藥店；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸銨、95%乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 電子分析天平（JY3002），上海良平儀器有限公司；中草藥粉碎機（FW-135），天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-GF101-3-S），上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DB），昆山市超聲儀器有限公司；紫外-可見分光光度計（型號UV-9600），北京瑞利分析儀器有限公司；循環(huán)水多用真空泵（SHZ-DⅢ），鞏義市科瑞儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)張喜峰等（2013）方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：Y=10.7188X＋0.0378，R2=0.9992。

1.3.2 樣品制備及總黃酮含量的測定 絞股藍(lán)藥材除雜后置于60℃恒溫干燥箱中干燥24 h，粉碎后過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，用封口袋密封備用。準(zhǔn)確稱量預(yù)處理過的絞股藍(lán)粉末2.00 g，加入到按照一定料液比加入不同濃度的乙醇水溶液和適量硫酸銨配制成的雙水相體系中，放入到一定溫度、功率的超聲波清洗器中提取一定時間之后取出，進(jìn)行減壓抽濾，收集濾液至分液漏斗中，靜置，收集上清液于燒杯中，準(zhǔn)確量取一定體積的上清液于50 mL容量瓶中，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測定上清液的總黃酮濃度，超聲波輔助雙水相提取絞股藍(lán)總黃酮的提取量計算公式為：

式中：C為供試品中絞股藍(lán)總黃酮濃度，mg/mL；V為上清液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為絞股藍(lán)質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響 固定乙醇濃度為40%，硫酸銨的用量0.2 g/mL分別配制成料液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60（g/mL）穩(wěn)定的雙水相體系，加入稱取的絞股藍(lán)粉末2.00 g，置于超聲功率為240 W，超聲溫度50℃的超聲波清洗器中，水浴超聲30 min。由圖1可知，絞股藍(lán)黃酮提取量隨著料液比的增大呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢。當(dāng)料液比為1：30（g/mL）時，絞股藍(lán)總黃酮提取量最大。原因是隨著提取溶劑增多，增大了絞股藍(lán)粉末與提取液的接觸面積，促進(jìn)了黃酮的溶出（李琪等，2011）。繼續(xù)增加提取液，絞股藍(lán)粉末的溶出達(dá)到飽和或者絞股藍(lán)中一些醇溶性雜質(zhì)競爭性溶出促使黃酮提取量下降且變化緩慢。且當(dāng)料液比過大會造成溶劑和鹽溶液使用量增加，實際生產(chǎn)成本增加，也不利于后期的回收和利用。因此，選擇料液比為1：30（g/mL）進(jìn)行考察。

圖1 料液比對黃酮提取量的影響

2.1.2 乙醇濃度對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響固定料液比1:30（g/mL），分別用濃度為35%、40%、45%、50%、55%的乙醇溶液與硫酸銨配制成穩(wěn)定的雙水相體系，硫酸銨用量固定為0.2 g/mL，加入絞股藍(lán)粉末2.00 g，置于超聲功率為240 W，超聲溫度為50℃的超聲波清洗器中，水浴超聲30 min。由圖2可知，在乙醇濃度達(dá)到50%之前，絞股藍(lán)總黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加，而當(dāng)乙醇濃度為50%，絞股藍(lán)總黃酮提取量達(dá)到極值，繼續(xù)增大乙醇的濃度。絞股藍(lán)總黃酮提取量逐漸下降。原因是硫酸銨的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，分相能力也就增大，上相中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)也就隨之增加，黃酮在乙醇中的溶解度比水中大得多。而且當(dāng)乙醇濃度較小時，溶劑的極性較高；隨著乙醇濃度的增加，溶劑的極性逐漸降低，因此總黃酮提取量隨之增加（李建鳳等，2020），當(dāng)乙醇濃度大于50%時，硫酸銨開始飽和析出，影響總黃酮的浸出，且此時溶劑的極性過低，從而導(dǎo)致總黃酮提取量開始降低，結(jié)合雙水相體系的穩(wěn)定性，選擇乙醇濃度為50%的雙水相體系進(jìn)行考察。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取量的影響

2.1.3 硫酸銨用量對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響固定料液比1:30（g/mL），用濃度為50%乙醇溶液與硫酸銨分別配制硫酸銨用量為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL穩(wěn)定的雙水相體系，加入絞股藍(lán)粉末2.00 g，置于超聲功率為240 W，超聲溫度為50℃的超聲波清洗器中，水浴超聲30 min。由圖3可知，隨著硫酸銨用量的增大絞股藍(lán)總黃酮的提取量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，當(dāng)硫酸銨用量為0.25 g/mL時，提取量達(dá)到最大值。原因是硫酸銨的用量可以改變兩相在雙水相中體積分布，從而影響乙醇相中的分配。開始增大硫酸銨的用量時，硫酸銨與乙醇溶液中水分快速結(jié)合形成雙水相中的下相，使得乙醇相中的乙醇濃度增大。當(dāng)硫酸銨的用量過大，硫酸銨水溶液達(dá)到飽和，兩相中的乙醇相體積過少，并伴有硫酸銨析出，從而使總黃酮提取量下降（林金清等，2004）。因此，選擇硫酸銨用量為0.25 g/mL為最佳。

圖3 硫酸銨用量對黃酮提取量的影響

2.1.4 超聲功率對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響固定料液比1:30（g/mL），用濃度為50%乙醇溶液與硫酸銨配制成硫酸銨用量為0.25 g/mL穩(wěn)定的雙水相體系，加入絞股藍(lán)粉末2.00 g，分別置于超聲功率為180、210、240、270、300 W，超聲溫度為50℃的超聲波清洗器中，水浴超聲30 min。由圖4可知，當(dāng)其他條件不變的情況下，絞股藍(lán)總黃酮的提取量隨著超聲功率的變化而變化，超聲功率為240 W時提取量達(dá)最大值，繼續(xù)加大超聲功率，總黃酮提取量逐漸下降。原因是當(dāng)增加超聲功率加速了絞股藍(lán)粉末在提取液中運動，從而增加黃酮的溶出，繼續(xù)增大超聲功率時，可能由于超聲波功率效應(yīng)促使黃酮類成分發(fā)生降解、聚合等反應(yīng)，使黃酮類提取量下降（玉瀾等，2014）。因此，超聲功率選擇240 W為宜。

圖4 超聲功率對黃酮提取量的影響

2.1.5 超聲時間對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響固定料液比1:30（g/mL），用濃度為50%乙醇溶液與硫酸銨配制成硫酸銨用量為0.25 g/mL穩(wěn)定的雙水相體系，加入稱取的絞股藍(lán)粉末2.00 g，置于超聲功率為240 W，超聲溫度為50℃超聲波清洗器中，分別水浴超聲10、20、30、40、50 min。由圖5可知，當(dāng)其他條件不變的情況下，絞股藍(lán)總黃酮提取量隨著超聲時間的增加，先上升再穩(wěn)定在一定水平后下降，當(dāng)超聲時間為20～40 min時，總黃酮提取量穩(wěn)定在12.52～12.92 g/mg，繼續(xù)增大超聲時間，絞股藍(lán)總黃酮的提取量下降，原因是繼續(xù)增大超聲時間，絞股藍(lán)中的皂苷類物質(zhì)溶出，使黃酮類物質(zhì)在上相的溶出量減少，下相的溶出量增多，從而降低總黃酮的提取量（王青豪等，2012）。因此，提取時間40 min為宜。

圖5 超聲時間對黃酮提取量的影響

2.1.6 超聲溫度對絞股藍(lán)總黃酮提取量的影響固定料液比1:30（g/mL），用濃度為50%乙醇溶液與硫酸銨配制成硫酸銨用量為0.25 g/mL穩(wěn)定的雙水相體系，加入稱取的絞股藍(lán)粉末2.00 g，分別置于超聲溫度為40、50、60、70、80℃，超聲功率為240 W的超聲波清洗器中，水浴超聲時間40 min。由圖6可知，在提取溫度較低情況下，提高超聲溫度對總黃酮提取量的影響不大，當(dāng)超聲溫度達(dá)到50℃之后，對總黃酮提取量影響較大，超聲溫度為50～70℃，總黃酮提取量隨著溫度的升高而增加，當(dāng)超聲溫度為70℃時，提取量達(dá)到極值，再繼續(xù)增大超聲溫度，總黃酮提取量下降。原因是由于溫度過高，使部分黃酮發(fā)生分解、氧化等反應(yīng)，總黃酮提取量降低。因此，最佳提取溫度為70℃。

圖6 超聲溫度對黃酮提取量的影響

2.2 正交試驗 通過單因素試驗結(jié)果可知，超聲時間在20～40 min，黃酮的提取量都比較穩(wěn)定，因此固定超聲時間為40 min，選取料液比、乙醇濃度、硫酸銨用量、超聲功率、超聲溫度5個因素對絞股藍(lán)總黃酮提取量進(jìn)行正交試驗設(shè)計，正交試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 因素與水平

2.2.1 正交試驗結(jié)果及分析 根據(jù)正交試驗設(shè)計對料液比、乙醇濃度、硫酸銨濃度、超聲功率、超聲溫度進(jìn)行5因素4水平L16（45）正交試驗，經(jīng)過公式運算，得出正交設(shè)計結(jié)果（表2）。

表2 正交試驗結(jié)果分析

由正交試驗結(jié)果極差分析可知，料液比（A）、乙醇濃度（B）、硫酸銨用量（C）、超聲功率（D）和超聲溫度（D）對絞股藍(lán)總黃酮提取量都有一定的影響，其中影響大小的次序為：料液比＞乙醇濃度＞硫酸銨用量＞超聲功率＞超聲溫度。最優(yōu)的提取工藝為A2B3C2D2E3，即料液比為1:30（g/mL），乙醇濃度為50%，硫酸銨用量為0.25 g/mL，超聲功率為240 W，超聲溫度為70℃。

2.2.2 驗證試驗 通過單因素試驗和正交試驗結(jié)果分析，選取料液比為1:30（g/mL），乙醇濃度為50%，硫酸銨用量為0.25 g/mL，超聲功率為240 W，超聲時間為40 min，超聲溫度為70℃，做最優(yōu)水平搭配驗證試驗，進(jìn)行3組平行試驗得到總黃酮平均提取量為15.90 mg/g。

3 結(jié)論

本試驗通過超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取絞股藍(lán)中的總黃酮，以總黃酮的提取量為評價指標(biāo)，經(jīng)過單因素試驗并結(jié)合正交試驗得到最佳提取工藝為：料液比1：30（g/mL），乙醇濃度50%，硫酸銨用量0.25 g/mL，超聲提取功率240 W，超聲提取時間40 min，超聲提取溫度70℃。在此條件下，總黃酮提取量最高為15.90 mg/g。