響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草子實(shí)體蟲草素提取工藝*

李劍梅，郝 捷，池景良，張疏雨，柴林山，朱萬芹

（1．遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000；2．內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

蛹蟲草（Cordyceps militarys） 又名北冬蟲夏草，屬于真菌門（Fungi）子囊菌亞門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes） 肉座菌亞綱（Hypocreomyce－tidae） 肉座菌目 （Hypocreales） 蟲草科（Cordy－cipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps），是一種具有多種藥理功能的食（藥） 用菌[1－2]。研究表明，蛹蟲草子實(shí)體中含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖、麥角甾醇、氨基酸等多種生理活性物質(zhì)，具有很高的藥用和保健價(jià)值，其中蟲草素（cordycepin） 即3’－脫氧腺苷（3’－deoxyadenosine），是首先從真菌中分離出來的核苷類抗菌素，在抑菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、抗血小板凝集、改善記憶力等方面發(fā)揮作用。目前，已有不少以蟲草素為主要成分的藥品、保健品及化妝品研發(fā)成果，如蟲草素膠囊、用于治療動(dòng)脈粥樣硬化及抗抑郁的藥物等，我國由蟲草素合成的治療白血病的新藥也已進(jìn)入Ⅰ期臨床階段[3－6]。試驗(yàn)依據(jù)蟲草素溶于水、熱乙醇的理化性質(zhì)，采用回流水浴提取技術(shù)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)方法優(yōu)化蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素提取工藝，以提升蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素提取效率，為蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素充分提取及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

蛹蟲草子實(shí)體，由遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌研究室提供，取1 kg蛹蟲草子實(shí)體于55℃鼓風(fēng)干燥箱干燥至恒重，粉碎，過80目篩，備用。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品（純度≥98%），索萊寶生物公司；乙腈，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；色譜純、無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters2695型高效液相色譜儀，美國waters公司；色譜柱 Agilent ZORBAXEclipseXDB-Cl8（4.6 mm×250 mL TI，5 mm），安捷倫科技（中國） 有限公司；SL-H-4水浴鍋，江蘇榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蟲草素含量測(cè)定

1） 標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，去離子水溶解，用流動(dòng)相（乙腈5%、去離子水95%） 定容至100 mL，搖勻，配成濃度為100 μg·mL-1蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取蟲草素儲(chǔ)備液0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL、12.50 mL，置于 25 mL容量瓶中，用去離子水定容，稀釋成1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、20.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2） 樣品溶液

準(zhǔn)確稱取蛹蟲草子實(shí)體粉末1.0 g，置于磨口三角瓶中，回流水浴提取，4 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，用去離子水定容至100 mL，搖勻；準(zhǔn)確量取提取液5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

3） 色譜條件

色譜柱為 Agilent ZORBAXEclipseXDB-Cl8 （4．6 mm×250 mL TI，5 mm）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長：260 nm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈-水（乙腈5%、去離子水95%）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

各因素固定值分別為10%乙醇提取、料液比1∶30、提取溫度80℃、提取時(shí)間2 h。保持其他3個(gè)因素不變，每次改變1個(gè)因素。各因素水平分別為：乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%；提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃；提取時(shí)間分別為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h；料液比 （g∶mL） 分別為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50、1∶60。采用外標(biāo)法，利用高效液相色儀測(cè)定供試樣品液中蟲草素吸收峰面積，按照蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算供測(cè)樣品液中蟲草素濃度，蟲草素得率（M，‰）公式為：

式中：C為供測(cè)樣品液中蟲草素濃度（μg·mL-1）；V為供測(cè)樣品液體積（mL）；M0為供測(cè)蛹蟲草子實(shí)體粉的質(zhì)量（g）；f為供測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、料液比（D） 為變量因素，以蟲草素得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.7軟件和BBD設(shè)計(jì)方案，建立4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，確定最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜測(cè)定結(jié)果

各蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣后，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 HPLC法蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

由圖1可得蟲草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=33 477X+13 493（R2=0.999 9）。其表明蟲草素在1.00 μg·mL-1～50.00 μg·mL-1的濃度內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3。

由圖2、圖3可知，在規(guī)定的色譜條件下，供試樣品與蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同的保留時(shí)間出現(xiàn)了蟲草素特征吸收峰，且樣品色譜峰分離效果良好。

圖2 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of cordycepin standard

圖3 供試樣品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of sample

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲草素得率的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲草素得率影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of cordycepin

由圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟲草素得率的影響較大，起初隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，蟲草素得率隨之升高，當(dāng)濃度達(dá)到20%時(shí)，蟲草素得率最高（5.575‰），隨后呈下降趨勢(shì)?？赡苡捎谠谝欢ㄒ掖俭w積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，其可促進(jìn)蟲草素的釋放，濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)迅速變性，反而不利于蟲草素的提取，同時(shí)隨著乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大，脂溶性雜質(zhì)的成分溶出量增加，可與乙醇、水分子結(jié)合，為蟲草素的競爭性抑制劑，導(dǎo)致蟲草素得率降低[7-8]。因此，最適提取溶劑為20%乙醇溶液。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)蟲草素得率的影響

提取時(shí)間對(duì)蟲草素得率的影響見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)蟲草素得率影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of cordycepin

由圖5可知，在提取時(shí)間小于2 h時(shí)限內(nèi)，蟲草素得率隨著時(shí)間的延長呈快速增加趨勢(shì)，提取時(shí)間為2 h時(shí)，蟲草素得率快速達(dá)到較高水平（5.611‰），然后隨著提取時(shí)間的延長，蟲草素得率呈緩慢增加趨勢(shì)，提取時(shí)間為4 h時(shí)蟲草素得率達(dá)到極值（5.700‰），蟲草素得率與提取2 h時(shí)蟲草素得率相近，提高幅度較小，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中能耗成本及提取工作效率，選擇蟲草素最佳提取時(shí)間為2 h。

2.2.3 不同提取溫度對(duì)蟲草素得率的影響

不同提取溫度對(duì)蟲草素得率的影響見圖6。

吊腳樓不僅憑借著大自然得天獨(dú)厚的條件和清秀古樸的造型使人眼前一亮；更因各族人民多少年來的辛勤堅(jiān)韌以及聰明才智而兼具統(tǒng)一、均衡、對(duì)稱、幾何、線條、尺度、邏輯等簡潔、嚴(yán)謹(jǐn)有序的數(shù)學(xué)之美，使人心馳神往。

圖6 溫度對(duì)蟲草素濃度影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of cordycepin

由圖6可知，50℃～80℃時(shí)，蟲草素得率隨著提取溫度的升高而增加，80℃時(shí)得率達(dá)到最大值（5.781‰），后隨著溫度的升高蟲草素得率略有下降。原因可能是由于熱能的增加增大溶劑對(duì)物料的破壞力，進(jìn)而促進(jìn)了蟲草素的溶出速率，但隨著溫度的升高，其他物質(zhì)的溶出速率增大，增加了溶液的粘稠度，影響了蟲草素提取效率。故蟲草素提取溫度選擇80℃較為合適。

2.2.4 不同料液比對(duì)蟲草素提取濃度的影響

不同料液比對(duì)蟲草素提取濃度的影響見圖7。

圖7 料液比對(duì)蟲草素濃度影響Fig.7 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of cordycepin

由圖7可知，不同料液比對(duì)蟲草素得率的影響較明顯，呈先增加后下降趨勢(shì)，其中料液比為1∶40時(shí)蟲草素得率最高（5.779‰）；后隨著液料比繼續(xù)增大，蟲草素得率隨之下降。因此，提取的液料比選擇1∶40較為合適。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與回歸方程擬合

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面 Box-Behnken模型試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、提取液料比（D）為自變量，以蟲草素得率為因變量，在4因素3水平上進(jìn)行27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1，各因素編碼水平及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab.1 Design factors and level of response surface test

以表2蟲草素得率為響應(yīng)值（Y），獲得的二次多元回歸方程為：Y=3.862+0.011A+0.217B+0.021C+0.051D+9.500×10-4AB+3.425×10-4AC+5.250×10-5AD-2.750×10-4BC+1.375×10-3BD-4.725×10-4CD-1.104×10-4A2-0.079B2-6.642×10-4C2-5.892×10-4D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results with response variables

2.3.2 模型方差及可信度分析

回歸方程模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型模型方差及可信度分析Tab.3 Analysis on variance and reliability of regression model

由表3可知，此模型達(dá)到極顯著水平（P<0.000 1），模型回歸顯著可靠，且失擬項(xiàng)P值為0.319 6（P>0.05） 不顯著，說明在試驗(yàn)過程中未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小；模型調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.936 6，表明在蟲草素回流水浴提取工藝中，約有93.66%的變異分布在所研究的4個(gè)因素中；相關(guān)系數(shù)R2=0.970 8，表明該方程較好的反應(yīng)了蟲草素得率與提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比的關(guān)系，蟲草素得率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合相關(guān)性。因此，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

一次性顯著性檢驗(yàn)，各因素對(duì)蟲草素得率的影響大小依次為：提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比；二次項(xiàng)中B2、C2、D2顯著性水平為極顯著（P<0.01），A2不顯著（P>0.05）；交互項(xiàng)中AC、CD的交互作用（P<0.01）對(duì)蟲草素得率的影響呈極顯著的正相關(guān)，AD、BC、BD交互項(xiàng)對(duì)蟲草素得率的的影響不顯著（P>0.05）。

2.3.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面曲面坡度和等高線形狀能直觀反應(yīng)各試驗(yàn)因素及兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值蟲草素得率的影響，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖9、圖10。

圖9 因素CD和因素AC交互作用對(duì)蟲草素提取濃度影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.9 Response surface diagram and contours of the interaction of parameters CD and AC on the extraction concentration of cordycepin

由圖9、圖10可以看出，各因素間的交互作用所形成的響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，蟲草素的得率由四周向內(nèi)逐漸增大，中心位置曲面最高處達(dá)到最大值，說明該模型具有極值。5種交互作用對(duì)蟲草素得率的影響程度不盡相同，相比而言，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比（CD）、溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)（AC）、提取溫度與時(shí)間（AB）、提取溫度與料液比（AD）交互作用的響應(yīng)面坡度陡峭，等高線呈典型的橢圓形及鞍形，對(duì)蟲草素提取濃度的影響顯著；提取時(shí)間與料液比（BD）、提取時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)（BC）交互作用的響應(yīng)面坡度較陡，等高線為圓形，對(duì)蟲草素提取得率影響不顯著。

圖10 因素AB、AD、BD、BC交互作用對(duì)蟲草素提取濃度影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.10 Response surface diagram and contours of the interaction of parameters AB,AD,BD,BC on the extraction concentration of cordycepin

通過分析及預(yù)測(cè)，獲得蟲草素最優(yōu)提取工藝條件及響應(yīng)值的極值，即在提取溫度90℃、提取時(shí)間2.23 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)24.11%、料液比1∶40時(shí)，蟲草素得率最大預(yù)測(cè)值為5.922‰。考慮到生產(chǎn)實(shí)際中可操作性，對(duì)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了修正，確定優(yōu)化的提取工藝為：提取溫度90℃、提取時(shí)間2 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、料液比1∶40。

2.3.4 優(yōu)化條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最佳提取條件下，進(jìn)行3次平行提取驗(yàn)證試驗(yàn)，蟲草素得率分別為5.910‰、5.917‰、5.928‰，平均值為5.918‰，與理論預(yù)測(cè)值相近（5.922‰），誤差較小，表明優(yōu)化工藝合理、可靠，可以用來指導(dǎo)蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的提取。

3 結(jié)論

目前，蟲草素的提取方法主要有浸提法、回流水浴提取法、超聲波法、超臨界萃取等，其中回流提取方法相對(duì)于超聲提取、超臨界提取等常用提取方法具有操作簡單、溶劑用量少、設(shè)備成本低、穩(wěn)定性好和易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，且提取溶劑的乙醇可回收循環(huán)使用，在規(guī)?；a(chǎn)中具有較高的實(shí)用價(jià)值[9-10]。試驗(yàn)以回流水浴為提取方法，通過單因素試驗(yàn)探索了影響蟲草素得率的主要因素，并應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行了蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素提取工藝參數(shù)的優(yōu)化，確定優(yōu)化的提取工藝為：提取溫度90℃、提取時(shí)間2 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)25%、料液比1∶40。在該工藝條件下，蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的得率與與理論預(yù)測(cè)值相近，工藝合理、可靠，為蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素的高效提取及產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。