大球蓋菇新品種“中菌金球蓋1號(hào)”選育*

張俊波，劉紹雄，華 蓉，李建英，尚陸娥，劉春麗，劉祈猛，羅孝坤，孫達(dá)鋒，**

（1．中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南 昆明 650221）

大球蓋菇 （Stropharia rugosoannulata Farl．ex Murrill）隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidomycota）層菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 球蓋菇科（Strophariaceae） 球蓋菇屬（Stropharia）。別名皺環(huán)球蓋故、酒紅色球蓋菇、皺球蓋等，商品名為赤松茸[1－3]。

大球蓋菇是一種營(yíng)養(yǎng)豐富、口味鮮美、品質(zhì)優(yōu)良的珍稀食用菌，也是在抗腫瘤活性方面極具開(kāi)發(fā)潛力的藥用真菌[4]。近年來(lái)，由于食用菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，特別是棚室等保護(hù)地的集約化，以及工廠化食用菌產(chǎn)業(yè)的快速擴(kuò)張，使大球蓋菇發(fā)展相對(duì)滯后，大球蓋菇的研究也相對(duì)薄弱，以至于一度成為小宗品種，只在部分省份局部栽培[1-6]。對(duì)大球蓋菇研究包括化學(xué)成分研究、胞外酶研究、生物學(xué)特性、原生質(zhì)體再生及單核化研究、栽培研究、加工方法研究、其他應(yīng)用價(jià)值研究等[5]。

大球蓋菇是生物分解農(nóng)作物下腳料的能手，以谷物秸稈和糞肥為主要栽培料，栽培出菇的同時(shí)又解決了環(huán)境污染問(wèn)題，成為生態(tài)農(nóng)業(yè)的生力軍[7]。大球蓋菇產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低；營(yíng)養(yǎng)豐富，易被消費(fèi)者接受，同時(shí)又能有效消納秸稈，減少面源污染、培肥地力、變廢為寶、改善生態(tài)環(huán)境、增加農(nóng)民收入。因此是精準(zhǔn)扶貧、栽培結(jié)構(gòu)調(diào)整、林業(yè)產(chǎn)業(yè)和礦區(qū)經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型的示范項(xiàng)目，各地紛紛出臺(tái)優(yōu)惠扶持政策，促進(jìn)了大球蓋菇的迅速發(fā)展。目前大球蓋菇除鮮品外，還有以腌漬品、干品為主流的產(chǎn)品，深加工研究也在不斷深入，產(chǎn)品品類不斷擴(kuò)大，正處于蓬勃發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期[8-10]。

大球蓋菇的栽培原材料豐富，玉米秸稈、麥稈、玉米芯、雜木屑等均可栽培；栽培技術(shù)簡(jiǎn)便粗放，生料栽培、發(fā)酵料栽培均可，技術(shù)門(mén)檻低，且容易獲得成功和高產(chǎn)，栽培效益好；林下、套種、露天、棚栽均可，栽培模式多樣，品種抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)溫度范圍廣；生態(tài)效益好，社會(huì)效益突出，能有效促進(jìn)產(chǎn)業(yè)融合[1-10]。

目前與大球蓋菇相關(guān)的專利較多，其中大部分為培養(yǎng)基制備、培養(yǎng)料制備和栽培方法，其次為深加工類。從培養(yǎng)基、培養(yǎng)料、栽培，再到深加工的諸多專利不斷的推進(jìn)著大球蓋菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

然而，目前市場(chǎng)上常售賣(mài)的大球蓋菇為菌蓋紅褐色至葡萄酒紅色，或暗褐色品種，且市場(chǎng)需求在逐年擴(kuò)大。但品種單一制約其發(fā)展，消費(fèi)者可選擇品種較少[1-2，8-11]。本研究中培育的新品種，改善了大球蓋菇品種單一的問(wèn)題，能有力推動(dòng)大球蓋菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展，推動(dòng)食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著大球蓋菇產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，所選育的金黃色大球蓋菇新品種，填補(bǔ)了市場(chǎng)品種空白，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

金黃色大球蓋菇品種，是由常規(guī)的酒紅色大球蓋菇在長(zhǎng)期栽培過(guò)程中發(fā)生變異而產(chǎn)生，其菌蓋顏色的改變且開(kāi)傘后菌褶顏色較淺，屬優(yōu)良變異；所選育的新品種金黃色大球蓋菇在“香、味”兼具的前提下，其最新的特點(diǎn)是顏色為金黃色，成為最突出的亮點(diǎn)具有極大市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)[12]。大球蓋菇已逐漸被市場(chǎng)所接受，研究所選育的金黃色大球蓋菇將具有巨大的市場(chǎng)潛力。

1 試驗(yàn)方法

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21125-2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范[13]對(duì)其進(jìn)行選育。具體選育程序?yàn)閷?duì)品種和野生種質(zhì)資源收集→純菌種分離→菌種培養(yǎng)→生理性能測(cè)定→初篩→復(fù)篩→區(qū)別性鑒定（形態(tài)、生理、同工酶、DNA指紋） →中間試驗(yàn)→示范栽培→優(yōu)良品種。

按照上述常規(guī)育種的程序，對(duì)選育的大球蓋菇菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性比較及馴化栽培研究。根據(jù)菌株菌絲體生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)等參數(shù)，結(jié)合拮抗試驗(yàn)、DNA比對(duì)分析，完成品種的室內(nèi)初步鑒定；通過(guò)栽培馴化，品種比較試驗(yàn)，初步篩選出菌株編號(hào)為ZJJQG001的大球蓋菇菌株。2019年～2021年在云南省昆明市晉寧區(qū)寶峰鎮(zhèn)進(jìn)行了初篩、復(fù)篩及中間試驗(yàn)，以四川省認(rèn)定品種川審菌2004004大球蓋菇1號(hào)（菌株由四川菇之源生物科技有限公司提供）為對(duì)照。

1.1 菌株篩選

2017年3月，選育組于云南省昆明市盤(pán)龍區(qū)雙龍鄉(xiāng)大球蓋菇栽培基地發(fā)現(xiàn)金黃色大球蓋菇變異子實(shí)體。通過(guò)PDA培養(yǎng)基分離獲得金黃色大球蓋菇菌株，其子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。在25℃恒溫暗培養(yǎng)，比較生長(zhǎng)速度、粗壯程度、濃密度等菌絲長(zhǎng)勢(shì)，最終篩選出菌絲長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)菌株ZJJQG001。

圖1 變異大球蓋菇圖片F(xiàn)ig.1 Picture of mutations Stropharia rugosoannulata

由圖1可知，本研究菌株來(lái)源于酒紅色大球蓋菇自然變異子實(shí)體，通過(guò)自然變異子實(shí)體分離獲得。酒紅色大球蓋菇子實(shí)體生長(zhǎng)初期為淺白色，隨著進(jìn)一步的生長(zhǎng)發(fā)育，菇蓋顏色漸變?yōu)榧t褐色至暗褐色或葡萄酒紅褐色。變異子實(shí)體與酒紅色大球蓋菇最大的區(qū)別為菌蓋淺黃色至金黃色，其他特征與酒紅色大球蓋菇相同。

1.2 出菇試驗(yàn)

原種、栽培種配方：木屑40%、棉籽殼40%、麥麩13%、玉米粉5%、白糖1%、石膏1%，含水量約60%。

發(fā)酵料配方：木屑42%、谷殼30%、玉米芯20%、麥麩或米糠5%、石膏1%、石灰1%、過(guò)磷酸鈣1%。

子實(shí)體階段最適生長(zhǎng)環(huán)境溫度為15℃～26℃，因此在自然條件下可在春、秋兩季栽培[1-3]，試驗(yàn)選擇在秋季栽培。另可根據(jù)大球蓋菇的生物學(xué)特性、當(dāng)?shù)貧夂蚝驮耘嘣O(shè)施等條件而定。其栽培場(chǎng)地選擇接近水源、排灌方便、土壤肥沃、避風(fēng)向陽(yáng)、交通方便、背風(fēng)、土質(zhì)疏松、富含腐殖質(zhì)、有機(jī)質(zhì)含量高的場(chǎng)所[4-6]。

1.2.1 栽培方法

參照大球蓋菇一般栽培程序“做床→鋪料→播種→打孔→覆土→覆蓋物→發(fā)菌管理→催菇→出菇管理→采收”進(jìn)行出菇試驗(yàn)[5-7，9]。

1）做床

場(chǎng)地殺菌滅蟲(chóng)后，栽培料調(diào)節(jié)水份75%，發(fā)酵料溫度降至25℃以下時(shí)開(kāi)始鋪料。床寬1.0 m～1.5 m，過(guò)道寬30 cm（南北走向?yàn)楹茫?。輔料前床面撒一層石灰粉。

2） 鋪料及播種

播種前，菌種外袋過(guò)石灰水（殺滅菌袋表面的雜菌），后脫袋播種。以3層料2層菌種的方式播種。第1層料約8 cm～10 cm，料層平整，厚度均勻。第2層菌種播種完成后，在上面鋪第3層料，厚約3 cm，將菌種蓋嚴(yán)。

3） 打孔

在料床側(cè)面扎2排直徑5 cm的孔洞至料床中心下部，呈“品”字形?？组g隔約20 cm。為菌絲生長(zhǎng)提供充足氧氣，防止料中心高溫?zé)?/p>

4） 覆土

播種后立即覆土，覆土厚度以3 cm～4 cm為好（早出菇覆土?。?。

5） 覆蓋物

播種完成后，加蓋覆蓋物，如稻草、松針等，覆蓋物要經(jīng)過(guò)石灰水消毒。冬季覆膜增溫、保濕。

6） 發(fā)菌管理

播種后2 d～3 d萌發(fā)，3 d～4 d開(kāi)始吃料；播種早可防止高溫?zé)?，料溫控制?0℃～30℃，不超過(guò)35℃；通常播種后20 d內(nèi)不噴水或少噴水，根據(jù)料濕度情況而定；一般20 d后菌絲吃料達(dá)1/2以上時(shí)，加大菇床四周噴水，保持土壤水分和空氣濕度。

7） 催菇

大約40 d～60 d菌絲吃透培養(yǎng)料，覆土層充滿菌絲，菌絲束扭結(jié)增粗，即可進(jìn)行催菇管理。噴一次催菇重水，加大通風(fēng)，降低棚內(nèi)溫度15℃～20℃，刺激原基形成。

8） 出菇管理

大球蓋菇由原基分化到子實(shí)體成熟一般需要5 d～8 d。保持溫度14℃～25℃，空氣相對(duì)濕度90%～95%，注意通風(fēng)，保證空氣新鮮。出菇期間水分管理較為重要，要堅(jiān)持勤噴輕噴、菇多多噴、菇少少噴、晴天重噴、雨天少噴或不噴的原則。

9） 采收

菌蓋外的一層菌膜剛破裂、菌蓋內(nèi)卷不開(kāi)傘、菌蓋呈鐘形時(shí)為采收適宜期；采完一潮后，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)水，經(jīng)過(guò)10 d～12 d開(kāi)始出第二潮，可連續(xù)采三潮～四潮。

1.3 分子生物學(xué)試驗(yàn)

用CTAB法分別提取菌株ZJJQG001的菌絲及栽培出菇子實(shí)體的基因組DNA，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)GelRed染色后進(jìn)行檢測(cè)。

以提取到的總DNA為模板，采用Mix混合試劑（湖南擎科生物技術(shù)有限公司），以ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 和 ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’） 為引物擴(kuò)增ITS（Internal Transcribed Spacer） 序列。PCR擴(kuò)增體系為 （25 μL） 2 × Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1引物各 0.5 μL，ddH2O 11 μL，DNA 模板 0.5 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，50℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保藏；以1%的瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行檢測(cè)，送至擎科生物技術(shù)完成測(cè)序。

1.4 品種選育試驗(yàn)

1.4.1 小試初篩

大球蓋菇按照1.2.1試驗(yàn)方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范要求，小試初篩試驗(yàn)設(shè)計(jì)每組栽培面積為5 m2，3組重復(fù)，按每667平方米（有效播種面積500 m2）菌種播種量300 kg計(jì)算，每平方米播種量為0.6 kg，每組菌種播種量為3 kg。有效播種面積內(nèi)發(fā)酵料5 000 kg，每平方米發(fā)酵料為10 kg，每組發(fā)酵料量為50 kg。產(chǎn)量測(cè)定為每組子實(shí)體總重量，子實(shí)體性狀檢測(cè)隨機(jī)抽取30個(gè)子實(shí)體計(jì)算平均值。

1.4.2 小試復(fù)篩

大球蓋菇1.2.1試驗(yàn)方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范要求。小試復(fù)篩試驗(yàn)設(shè)計(jì)每組栽培面積為10 m2，3組重復(fù)，按每667平方米（有效播種面積500 m2）菌種播種量300 kg計(jì)算，每平方米播種量為0.6 kg，每組菌種播種量為6 kg。有效播種面積內(nèi)發(fā)酵料5 000 kg，每平方米發(fā)酵料為10 kg，每組發(fā)酵料量為100 kg。

1.4.3 中間試驗(yàn)

大球蓋菇按1.2.1試驗(yàn)方法栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范要求。中間試驗(yàn)設(shè)計(jì)每組栽培面積為200 m2，按每667平方米（有效播種面積500 m2）菌種播種量300 kg計(jì)算，每平方米播種量為0.6 kg，菌種播種量為120 kg。有效播種面積內(nèi)發(fā)酵料5 000 kg，每平方米發(fā)酵料為10 kg，每組發(fā)酵料量為2 000 kg。

產(chǎn)量測(cè)定采用五點(diǎn)法測(cè)產(chǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)1 m2，產(chǎn)量按有效面積500 m2計(jì)算。子實(shí)體性狀隨機(jī)抽取30個(gè)子實(shí)體計(jì)算平均值。

1.4.4 示范栽培

測(cè)產(chǎn)菌種最終在云南省昆明市晉寧區(qū)寶峰鎮(zhèn)試驗(yàn)栽培，按GB/T 21125-2007食用菌品種選育技術(shù)規(guī)范要求。示范栽培試驗(yàn)設(shè)計(jì)栽培面積為1 000 m2（3次重復(fù)，每次重復(fù)栽培面積約333.5 m2），按每667平方米（有效播種面積500 m2）菌種播種量300 kg。以大球蓋菇1號(hào)菌種為對(duì)照。2個(gè)品種采用相同的菌種量（每667平方米菌種播種量300 kg） 和一致的示范栽培管理技術(shù)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌絲生長(zhǎng)情況

ZJJQG001菌株菌絲生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖2。

圖2 菌株ZJJQG001菌絲生長(zhǎng)情況Fig.2 Mycelial growth of strain ZJJQG001

由圖2可知，菌株ZJJQG001菌絲初期潔白、濃密、粗壯，生長(zhǎng)較快，后期分泌色素，中央部分呈淺黃色。

分離得到的ZJJQG001純菌株和大球蓋菇1號(hào)菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 拮抗試驗(yàn)Fig.3 Antagonism test

由圖3結(jié)果顯示，ZJJQG001純菌株和大球蓋菇1號(hào)菌株有較強(qiáng)的拮抗反應(yīng)，不具有親和性，形成“溝型”拮抗線。說(shuō)明ZJJQG001純菌株和大球蓋菇1號(hào)菌株為2個(gè)不同品種菌株。

2.2 選育結(jié)果

2.2.1 分子鑒定

ZJJQG001菌株ITS系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌株ZJJQG001菌絲體ITS序列與S.rugosoannulata序列 （KC176328.1） 覆蓋度達(dá)98%，相似度98.62%。其子實(shí)體ITS序列與S.rugosoannulata序列（KC176328.1） 覆蓋度達(dá)98%，相似度98.06%。通過(guò)使用BLAST軟件對(duì)大球蓋菇1號(hào)和菌株ZJJQG001菌絲體ITS序列進(jìn)行比對(duì)，兩者有約1%差異。因此，確定菌株ZJJQG001為大球蓋菇（S.rugosoannulata），將其品種定名為“中菌金球蓋1號(hào)”。

圖4 菌株ZJJQG001系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZJJQG001

2.2.2 小試初篩

菌株ZJJQG001小試初篩試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小試初篩出菇產(chǎn)量和性狀統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of fruiting yield and traits in preliminary screening of small test

由表1可以看出，菌株ZJJQG001小試初篩試驗(yàn)組出菇狀況良好，通過(guò)測(cè)產(chǎn)折算，結(jié)果表明第1組產(chǎn)量為6.45 kg·m-2，第 2組產(chǎn)量為6.90 kg·m-2，第 3組產(chǎn)量為 5.85 kg·m-2。3 組平均產(chǎn)量為 6.40 kg·m-2。試驗(yàn)結(jié)果較好，出菇整齊；菌蓋為金黃色，直徑8.4 cm；菌柄白色，長(zhǎng)11.3 cm，直徑5.4 cm，子實(shí)體平均單菇鮮重為46.8 g。平均優(yōu)質(zhì)菇率89%，說(shuō)明該金黃色大球蓋菇可以發(fā)展人工栽培。

2.2.3 小試復(fù)篩

菌株ZJJQG001小試復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小試復(fù)篩出菇產(chǎn)量和性狀統(tǒng)計(jì)Tab.2 Fruiting yield and characters statistics in secondary screening of small test

由表2可以看出，菌株ZJJQG001小試復(fù)篩試驗(yàn)出菇狀況良好，第1組產(chǎn)量為5.85 kg·m-2，第2組產(chǎn)量為 6.45 kg·m-2，第 3 組產(chǎn)量為 6.22 kg·m-2。3組平均產(chǎn)量為6.17 kg·m-2。出菇狀況較初篩更好，管理更成熟，優(yōu)質(zhì)菇有了明顯提高，出菇整齊，菌蓋為金黃色，直徑7.3 cm，菌柄白色，直徑4.7 cm，長(zhǎng)10.2 cm，子實(shí)體平均單菇鮮重為59.2 g，平均優(yōu)質(zhì)菇率91%。

2.2.4 中試試驗(yàn)

菌株ZJJQG001中試試驗(yàn)子實(shí)體性狀較好，出菇整齊，產(chǎn)量達(dá)6.79 kg·m-2，出菇整齊，菌蓋為金黃色，直徑5.3 cm，菌柄白色，直徑3.9 cm，長(zhǎng)8.1 cm，子實(shí)體單菇平均鮮重為61.6 g，優(yōu)質(zhì)菇率為92%。從初篩、復(fù)篩到中間試驗(yàn)，由于管理技術(shù)越來(lái)越成熟，產(chǎn)量穩(wěn)定提高。說(shuō)明菌株ZJJQG001出菇穩(wěn)定性較好。

2.2.5 示范栽培

通過(guò)示范栽培，菌株ZJJQG001均一性和穩(wěn)定性的調(diào)查分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 示范點(diǎn)菌株ZJJQG001產(chǎn)量Tab.3 Yield of strain ZJJQG001 in demonstration sites

由表3、表4可以看出，較對(duì)照的大球蓋菇1號(hào)，ZJJQG001菌株子實(shí)體菌蓋顏色為金黃色，無(wú)酒紅色出現(xiàn)，整體出菇效果好，單菇肥厚，老后菌褶不易變黑，優(yōu)質(zhì)菇率較高。2019年～2020年供試菌株多點(diǎn)示范平均產(chǎn)量分別為 6.04 kg·m-2、6.18 kg·m-2、6.15 kg·m-2，產(chǎn)量較高。且制作干片不用削皮處理，帶皮干片品質(zhì)接近大球蓋菇1號(hào)削皮干片。因此，ZJJQG001菌株可作為大球蓋菇新品種，增加市場(chǎng)產(chǎn)品種類選擇。

表4 示范點(diǎn)菌株ZJJQG001和大球蓋菇1號(hào)主要農(nóng)藝性狀Tab.4 Main agronomic performance of strain ZJJQG001 at demonstration site

3 品種特異性、穩(wěn)定性和一致性比較

中菌金球蓋1號(hào)栽培品種形態(tài)見(jiàn)圖5。

圖5 大球蓋菇新品種中菌金球蓋1號(hào)Fig.5 The new Stropharia rugosoannulata cultivar Zhongjun Jinqiugai No.1

中菌金球蓋1號(hào)為淡黃色至金黃色，大球蓋菇1號(hào)為酒紅色；大球蓋菇1號(hào)菌褶顏色為深褐色。中菌金球蓋1號(hào)，子實(shí)體叢生或單生，中等至較大。菌蓋接近半球形，成熟后趨于扁平，直徑一般為5 cm～25 cm，較大的可達(dá)30 cm。子實(shí)體生長(zhǎng)初期菌蓋為金黃色，后期為淺黃色，開(kāi)傘后菌褶顏色為米黃色至淺灰色。菌褶密集排列且直生，初期白色，后期米黃色至淺灰色。適宜采收期，菌柄長(zhǎng)度一般為8 cm～12 cm，菌柄直徑一般為4 cm～7 cm，呈白色。通過(guò)觀察出菇性狀特征，中菌金球蓋1號(hào)具備一致性。