膽囊癌患者膽囊癌組織泛素結(jié)合酶E2T蛋白表達(dá)及其臨床意義探討*

于 濤，李奎武，姚 琳，呂 武

膽囊癌(gallbladder cancer，GBC)是最常見(jiàn)的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率約為2.5/10萬(wàn)。該病預(yù)后極差，5 a生存率僅為5%[1]。雖然外科根治性手術(shù)可提高患者長(zhǎng)期生存率，但由于該病發(fā)病較為隱匿，惡性程度較高，診斷時(shí)符合手術(shù)條件的患者占比較低，而失去手術(shù)機(jī)會(huì)的晚期GBC患者僅能接受放化療和靶向藥物等姑息性治療[2，3]。近年來(lái)，免疫治療在GBC患者的臨床治療方面受到廣泛的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)抑癌因子與腫瘤蛋白表達(dá)失衡對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的影響。泛素化是指包括泛素分子、泛素活化酶、泛素結(jié)合酶等多種分子在內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾過(guò)程，對(duì)于維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[4，5]。泛素酶E2T(ubiquitinase E2T，UBE2T)是泛素-蛋白酶系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究發(fā)現(xiàn)了UBE2T在結(jié)直腸癌、鼻咽癌和肝細(xì)胞癌表達(dá)顯著上調(diào)[6-8]，且在不同臨床和病理性參數(shù)人群其表達(dá)顯著不同，但其在膽囊癌組織的表達(dá)及其臨床意義尚不明確。本研究檢測(cè)了GBC患者膽囊癌組織UBE2T的表達(dá)情況，旨在為GBC的免疫發(fā)病機(jī)制和分子標(biāo)記物研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1月～2017年12月我院肝膽外科收治的膽囊癌患者50例，男26例，女24例；年齡為30～75歲，平均年齡為(60.0±6.8)歲。符合《CSCO膽道系統(tǒng)腫瘤診斷治療專(zhuān)家共識(shí)(2019年版)》的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查診斷，入院前未進(jìn)行過(guò)放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的肝、腎功能不全；②在治療過(guò)程中轉(zhuǎn)院或放棄治療；③圍術(shù)期或術(shù)后1個(gè)月內(nèi)死亡。分別選擇距離癌邊緣>5 cm的癌旁組織和本院收集的正常膽囊組織50例作為對(duì)照。納入對(duì)象簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料收集 通過(guò)電子病歷搜索和收集膽囊癌患者的一般資料，包括性別、年齡、TNM分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)。

1.3 膽囊組織UBE2T蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，自液氮中取出膽囊組織和癌組織，使用經(jīng)過(guò)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)和RIPA細(xì)胞裂解液，輕輕吹勻，置于4℃旋轉(zhuǎn)搖床上充分裂解，提取蛋白。采用BCA法對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量，調(diào)整蛋白濃度后加入4×蛋白上樣緩沖液，水浴鍋煮沸5 min，加入蛋白樣品80μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，經(jīng)過(guò)脫脂奶粉室溫封閉后，加入羊抗人UBE2T抗體(Abnova生物科技公司)，在37℃溫箱中孵育1～2 h，以PBST洗滌3次，加入二抗，采用ECL法顯色，在暗室中觀察。應(yīng)用ImagePro Plus 6.0軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.4 隨訪 采用門(mén)診復(fù)查或電話隨訪，患者自手術(shù)結(jié)束開(kāi)始接受隨訪，間隔3個(gè)月1次，隨訪終點(diǎn)為患者全因死亡，或截止至2020年3月1日。

2 結(jié)果

2.1 膽囊癌組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T蛋白表達(dá)情況 膽囊癌組織UBE2T蛋白表達(dá)量為2.9±0.4，顯著高于癌旁組織的(1.5±0.3)或正常膽囊組織的(1.7±0.3，P<0.05，圖1)。

圖1 不同組織UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的膽囊癌患者癌組織UBE2T蛋白表達(dá)水平比較 不同性別、年齡UBE2T表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，資料未列出)，而不同TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)組織UBE2T表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同特征的膽囊癌組織UBE2T蛋白表達(dá)比較

2.3 影響膽囊癌患者死亡的危險(xiǎn)因素分析 截止到隨訪終點(diǎn)，中位隨訪21.0個(gè)月，Logrank分析結(jié)果顯示，31例UBE2T高表達(dá)(>3.5)和19例低表達(dá)(<3.5)膽囊癌患者中位生存時(shí)間分別為12.0個(gè)月和25.0個(gè)月(P<0.05，圖2)；多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期高、UBE2T高表達(dá)、腫瘤浸潤(rùn)程度高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度高、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)高是膽囊癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2)。

表2 多元Logistic回歸分析膽囊癌患者死亡的危險(xiǎn)因素

3 討論

膽囊癌是一種總體發(fā)病率較低但生存情況較差的惡性疾病[10,11]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，國(guó)外女性與男性膽囊癌發(fā)病比例為2∶1～6∶1，而我國(guó)約為1.62∶1。在發(fā)病年齡方面，我國(guó)膽囊癌主要集中于60～69年齡段。目前，膽囊癌的臨床診斷和治療存在的主要問(wèn)題在于膽囊癌診斷較晚，處于I/II期人數(shù)占比較低，診斷時(shí)已處于IV期患者占比超過(guò)50%，說(shuō)明對(duì)該病的早期臨床診斷手段較為有限[12]。此外，可用于膽囊癌的免疫治療或靶向治療等精準(zhǔn)治療方法較少，僅有較少數(shù)的患者接受放療和化療治療，導(dǎo)致患者預(yù)后相對(duì)較差[13]。因此，迫切需要對(duì)膽囊癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究，尋找可靠的生物標(biāo)志物用于患者的早期診斷、靶向治療和預(yù)后判斷，對(duì)于延長(zhǎng)患者生命，提高生存率具有重要的意義。

泛素-蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-protease system，UPS)和泛素樣蛋白酶系統(tǒng)(ubiquitin-like protease system，UBL)是機(jī)體表觀遺傳修飾的關(guān)鍵機(jī)制，廣泛參與了胚胎發(fā)育和DNA修復(fù)損傷等生理過(guò)程[14，15]。蛋白質(zhì)泛素化是一種被嚴(yán)格調(diào)控的可逆性生理過(guò)程，主要通過(guò)泛素化和去泛素化分子發(fā)揮生物學(xué)功能，而泛素化和去泛素化分子修飾功能的動(dòng)態(tài)平衡既是維持底物蛋白半衰期穩(wěn)定的前提，還可維持細(xì)胞穩(wěn)定，對(duì)于腫瘤的免疫學(xué)過(guò)程產(chǎn)生直接的影響。泛素是真核生物特有的小蛋白質(zhì)，由76個(gè)氨基酸殘基組成，在進(jìn)化上高度保守，幾乎參與了真核細(xì)胞所有的信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程[16，17]。目前，發(fā)現(xiàn)的泛素化主要受到泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3組成的泛素化反應(yīng)體系的調(diào)控，其中泛素結(jié)合酶E2可催化泛素轉(zhuǎn)移過(guò)程，并進(jìn)一步受泛素連接酶的下游調(diào)控[18，19]。其中UBE2T最早因在范可尼貧血DNA修復(fù)損傷過(guò)程中的作用被發(fā)現(xiàn)，主要定位于染色體1q32.1上，在多種惡性腫瘤中存在明顯的擴(kuò)增現(xiàn)象。UBE2T可通過(guò)將FANCD2和FANCA等因子泛素化的方式，促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)，以維持基因組的完整性[20]。體外實(shí)驗(yàn)證明，下調(diào)UBE2T蛋白可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)于DNA交聯(lián)藥物的敏感性[21]。在結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤癌組織，UBE2T表達(dá)明顯升高[22，23]。本研究采用Western blot法檢測(cè)了膽囊癌患者膽囊組織、癌旁組織和正常膽囊組織UBE2T相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，膽囊癌患者膽囊組織UBE2T明顯高于癌旁組織或正常膽囊組織，而正常膽囊組織與癌旁組織UBE2T表達(dá)無(wú)明顯差異。因此，推測(cè)UBE2T可能影響了膽囊癌的發(fā)生過(guò)程。

已有學(xué)者報(bào)道了UBE2T與多種惡性腫瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系。隨著多發(fā)性骨髓瘤患者惡性程度增加UBE2T表達(dá)水平也升高，且與患者預(yù)后有關(guān)[24]。UBE2T高表達(dá)與乳腺癌和肺癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[25]。本研究結(jié)果表明，膽囊癌組織UBE2T蛋白表達(dá)與性別或年齡無(wú)關(guān)，不同TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移喝病理學(xué)分級(jí)癌組織該蛋白表達(dá)不同，提示UBE2T可能參與了膽囊癌的病情發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程[26]。因此，UBE2T作為判斷膽囊癌病情及預(yù)后的分子標(biāo)記物存在一定的潛力。本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析了不同UBE2T表達(dá)水平膽囊癌患者的預(yù)后情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UBE2T高表達(dá)患者預(yù)后顯著差于低表達(dá)的患者，提示UBE2T可作為膽囊癌患者的預(yù)后標(biāo)記，以指導(dǎo)臨床治療方案的決策。UBE2T在膽囊癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不明確，但在其他惡性腫瘤，已有研究確定了UBE2T影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。在膀胱癌，沉默UBE2T可導(dǎo)致細(xì)胞周期在G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。在骨肉瘤，UBE2T高表達(dá)可通過(guò)激活P13K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[28]。在非小細(xì)胞肺癌[29]，體外敲低UBE2T可通過(guò)抑制wnt/β-catenin通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程。

隨著科學(xué)研究的不斷推進(jìn)，蛋白質(zhì)泛素化作用在惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中參與蛋白質(zhì)降解并通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)各類(lèi)免疫細(xì)胞功能而影響先天免疫和適應(yīng)性免疫過(guò)程，其機(jī)制被不斷揭示，蛋白質(zhì)泛素化分子作為腫瘤治療靶點(diǎn)的價(jià)值也不斷顯現(xiàn)。本研究結(jié)果證明了膽囊癌患者膽囊組織UBE2T蛋白表達(dá)顯著升高，可能與病情及不良預(yù)后相關(guān)。