非酒精性脂肪性肝炎患者外周血跨膜蛋白6超家族成員2基因表達(dá)與心血管疾病的關(guān)系*

吳麗蒙，龔 翔，張 燕

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變和肝小葉炎癥為特征的臨床病理綜合征。心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是NASH患者的主要死亡原因。NASH患者發(fā)生CVD越嚴(yán)重，死亡的幾率越大[1]，表明CVD嚴(yán)重影響NASH病情進(jìn)展和預(yù)后。對(duì)NASH患者外周血跨膜蛋白6超家族成員2(transmembrane 6 superfamily member 2，TM6SF2)基因水平研究發(fā)現(xiàn)其基因變異可降低血脂水平或?qū)π难芗膊〉陌l(fā)生起保護(hù)作用，提示TM6SF2基因表達(dá)狀態(tài)或與NASH患者出現(xiàn)CVD有關(guān)[2]。TM6SF2為跨膜蛋白，其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，能夠調(diào)節(jié)膽固醇代謝，與早期動(dòng)脈粥樣硬化的形成有關(guān)[3]，但目前尚不知其與NASH患者出現(xiàn)CVD的內(nèi)在聯(lián)系。本研究通過(guò)分析NASH患者外周血TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性和CVD發(fā)生情況，探討了其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年9月～2020年9月我院診治的NASH患者93例，男51例，女42例；年齡為42～61歲，平均年齡為(55.8±7.6)歲。符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，BMI為(25.1±3.0)kg/m2。排除酒精性肝病、病毒性肝炎、自身免疫性肝病和藥物性肝損傷患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者簽署知情同意書。

1.2 外周血TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 取血液200 μl，加入緩沖液200 μl和蛋白酶K 20 μl，震蕩混勻，放置片刻，加入緩沖液BD 350 μl，充分混勻，離心，將混合液放入含有吸附柱的收集管中回收液體，然后依次加入緩沖液GDB 500 μl、漂洗液PWB 600 μl。每加入一種液體，均在12000 r/m下離心30 s，去除液體，而后于吸附膜中間位置滴加洗脫緩沖液TB 100 μl，室溫下放置2 min，在12000 r/m下離心2 min，獲得檢測(cè)樣本，使用紫外分光光度儀檢測(cè)DNA純度，加入ddH2O將DNA稀釋到20 μg/μl。應(yīng)用TaqMan探針?lè)ㄐ蠺M6SF2基因rs58542936位點(diǎn)分型，引物序列為rs58542936-F：TGTCTCAGAACAAACAAACAAACAGA；rs58542936-R：GTAGGGGG

TGGTGAGGAAGAAC。采用PCR法擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s、60℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。然后，將得到的樣品分裝至384孔板中，通過(guò)聚類分型和擴(kuò)增曲線進(jìn)行基因序列檢測(cè)，依據(jù)終點(diǎn)熒光的讀取，自動(dòng)行等位基因分型。對(duì)單獨(dú)出現(xiàn)一種熒光信號(hào)者，判定為純合性；同時(shí)出現(xiàn)兩種標(biāo)記的熒光信號(hào)者為雜合型。

1.3 心功能指標(biāo)檢測(cè) 使用Philip IE33型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為2.0～5.0 MHz，測(cè)量左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(intraarterial media thickness，IMT)。根據(jù)《實(shí)用臨床心腦血管病學(xué)》診斷CVD。

2 結(jié)果

2.1 TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)基因型和等位基因分布 本組經(jīng)超聲檢查，診斷合并CVD 35例；經(jīng)檢測(cè)，兩組TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡法則，基因型分布存在顯著性差異(P<0.05)，而等位基因T和C分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布(%)

2.2 NASH患者發(fā)生CVD的單因素分析 CVD組在BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、吸煙、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)為雜合型占比顯著高于NASH組(P<0.05，表2)。

表2 兩組有關(guān)指標(biāo)(%)比較

2.3 影響NASH患者發(fā)生CVD的多因素分析 經(jīng)多元Logistics回歸分析，發(fā)現(xiàn)BMI≥24 kg/m2、TC≥5.2 mmol/L、有心血管疾病家族史、合并糖尿病和TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)為雜合型是影響CVD發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05，表3)。

表3 NASH患者發(fā)生CVD的多因素分析

2.4 TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)純合型與雜合型患者血脂和心功能指標(biāo)比較 雜合型人群血清TC和TG水平顯著高于純合型，LVEF和IMT也顯著大于純合型(P<0.05，表4)。

表4 TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)純合型與雜合型血脂和心功能指標(biāo)比較

2.5 TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NASH患者發(fā)生CVD的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性預(yù)測(cè)NASH患者發(fā)生CVD的AUC為0.66395，95%CI為(0.590～0.731，P<0.05)。

3 討論

相關(guān)報(bào)道指出，TM6SF2基因參與肝細(xì)胞分泌極低密度脂蛋白的途徑，并能影響調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成[6-10]。TM6SF2位于19號(hào)染色體上，其表達(dá)具有一定的組織特異性，主要分布于腎臟、腦組織、小腸和肝臟中，可通過(guò)調(diào)節(jié)甘油三酯分泌、增加細(xì)胞內(nèi)濃度，影響肝臟脂質(zhì)代謝[11,12]，而心腦血管疾病的發(fā)生與機(jī)體血脂代謝異常存在密切聯(lián)系，提示TM6SF2基因多態(tài)性或與心腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)CVD患者進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI≥28kg/m2、TC≥5.17mmol/L、有心血管疾病家族史及TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)為雜合型是影響CVD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，表明CVD的發(fā)生與TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性等有關(guān)，這主要與血脂代謝異常可增加亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化及冠脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[13,14]。

NASH的發(fā)生與內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激和胰島素抵抗有關(guān)，NASH內(nèi)皮功能異常不僅會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)展，還會(huì)誘發(fā)CVD[15,16]。NASH脂質(zhì)代謝異常可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能改變，使內(nèi)皮細(xì)胞脫落壞死，并可增強(qiáng)單核細(xì)胞和T細(xì)胞的粘附，促進(jìn)其向內(nèi)皮下移行，還可誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)多種粘附分子，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，進(jìn)而可能會(huì)誘發(fā)CVD。而rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性與NASH患者機(jī)體脂代謝異常有關(guān)，提示其可能與CVD的發(fā)病過(guò)程有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)增加NASH患者CVD的風(fēng)險(xiǎn)，提示或可通過(guò)檢測(cè)該位點(diǎn)基因多態(tài)性來(lái)預(yù)測(cè)其是否會(huì)出現(xiàn)CVD。本研究中發(fā)現(xiàn)，TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)NASH患者出現(xiàn)CVD具有診斷價(jià)值。其原因在于，TM6SF2參與了PPAR的信號(hào)通路環(huán)節(jié)。而PPAR參與了全身和肝臟的脂質(zhì)代謝過(guò)程，可調(diào)節(jié)肝臟從外周組織攝取脂肪酸的能力及脂蛋白載運(yùn)能力，其表達(dá)異常時(shí)會(huì)導(dǎo)致脂肪在肝臟堆積，并能影響全身脂質(zhì)代謝[17,18]，故而會(huì)增加心腦血管發(fā)生的危險(xiǎn)性，故可通過(guò)檢測(cè)TM6SF2基因多態(tài)性來(lái)預(yù)測(cè)患者患CVD的概率。

內(nèi)臟脂肪組織被認(rèn)為是心血管事件和代謝狀況風(fēng)險(xiǎn)增加的重要指標(biāo)，而心外膜脂肪組織與內(nèi)臟脂肪組織有相同的胚胎起源，是沉積在心肌和心包之間的內(nèi)臟脂肪組織，可表達(dá)多種細(xì)胞因子和蛋白，影響血管內(nèi)皮功能。本研究發(fā)現(xiàn)，TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)雜合型TC、TG水平高于純合型，LVEF、IMT值大于純合型，表明TM6SF2基因rs58542936位點(diǎn)雜合型患者的心功能較差，這主要是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)基因多態(tài)性可能會(huì)抑制內(nèi)臟脂肪組織代謝，導(dǎo)致大量膽固醇在內(nèi)臟蓄積，并能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞血小板源性生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌增生，影響血管舒張、收縮及血液凝固過(guò)程，間接促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，而影響患者心臟功能。