成年突聾患者藥物聯(lián)合治療前后血清HIF-1α、VEGF的變化水平及臨床意義

劉紫荻，宋桂林

（湖南師范大學附屬長沙醫(yī)院，長沙 410006）

突發(fā)性聾（sudden sensorineural hearing loss，SSHL）為耳鼻咽喉科的常見急癥，其特點為起病急、發(fā)展快、治愈率低且易復發(fā)，并常伴隨耳鳴、耳悶、眩暈等癥狀，嚴重影響患者日常生活［1］。目前學術界較公認的成年SSHL發(fā)病機制主要為內耳微循環(huán)障礙［2］，因此探討缺氧相關標志物對明確成人SSHL發(fā)病機制、臨床治療及預后情況具有重要意義。缺氧誘導因子-1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）作為一個具有轉錄活性的核蛋白，能在機體缺氧環(huán)境下調控相關靶基因的轉錄、翻譯及表達，產生促進血管內皮細胞生長增殖、促進血管生成、提高血管通透性等作用，從而為缺血缺氧的組織提供保護作用［3］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是HIF-1α轉錄調控的下游靶基因之一，是目前已知的活性最強、專屬性最高的血管生成因子［4］。HIF-1α-VEGF 信號通路是一個受多種正向及負向調節(jié)信號嚴密控制、相互調節(jié)的網(wǎng)狀系統(tǒng)，并且存在于聽覺系統(tǒng)中［5］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，SSHL患者血清HIF-1α水平較健康體檢者明顯升高，提示SSHL患者發(fā)病過程中存在急性缺氧事件并可影響其血清HIF-1α的表達［6］。此外，我國最新指南［1］提出SSHL患者在發(fā)病急性期進行系統(tǒng)藥物聯(lián)合治療，聽力改善較好，甚至可痊愈，而錯過急性期則治療效果較差。本研究旨在了解成人SSHL患者藥物聯(lián)合治療的療效，探討治療前后血清中HIF-1α和VEGF表達水平的變化，以期為此類患者的臨床治療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年10月～2020年4月在我科診斷并住院治療的SSHL患者作為研究對象，且所有患者均符合以下標準：①符合2015年制定的《突發(fā)性聾診斷和治療指南》［1］的診斷標準；②年齡≥18歲；③初診時間≤21d（SSHL急性發(fā)作期）；③耳鼻咽喉科?？茩z查及影像學檢查排除外耳、中耳、內耳及中樞病變導致的感音神經性聾，排除耳毒性藥物、外傷、遺傳等其他相關因素所致的聽力損失；④排除合并腫瘤、自身免疫性疾病、代謝性疾病、嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全者；排除6個月內曾有重大軀體或精神創(chuàng)傷史、手術史者；排除已接受抗凝抗、抗氧化治療者。符合納入標準的患者共31人，其中男15例，女16例；平均年齡20～73歲（40.1±3.5）歲，患者均已簽署知情同意書。

1.2 治療方案成年SSHL患者入院后根據(jù)指南［1］予以藥物聯(lián)合治療，療程21d：①糖皮質類激素：倍他米松磷酸鈉注射液靜脈滴注（12mg+100mL 0.9%氯化鈉注射液）1次/d，連用5d后減半；②改善內耳微循環(huán)：舒血寧注射液（20mg+250mL 5%葡萄糖注射液）靜脈滴注，1次/d；尼莫地平片（20mg）口服，3次/d；鹽酸氟桂利嗪膠囊（5mg）口服，1次/d；③營養(yǎng)神經：甲鈷胺（0.5mg）口服，3次/d；維生素B12（0.25mg）口服，3次/d。

1.3 療效評價成年SSHL患者療程結束后復查純音聽閾，并根據(jù)指南［1］將療效分為4級，痊愈：受損頻率聽閾恢復正常、或達到患病前水平、或達到健耳水平；顯效：受損頻率平均聽力提高30dB以上；有效：受損頻率平均聽力提高15～30dB；無效：受損頻率平均聽力改善不足15dB?？傮w有效率計痊愈率、顯效率及有效率三者之和。

1.4 實驗方法

1.4.1 血清HIF-1α、VEGF水平的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行血清HIF-1α、VEGF水平的檢測。采集患者入院及治療完成日24h內的清晨空腹靜脈血3mL，不加抗凝劑，3000r/min離心20min，收集上層血清，每孔加標準品或待測樣本100L，37℃溫育2h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌4次，每次10s，加HIF-1α、VEGF抗體工作液100L，37℃溫育1h，PBS洗滌4次，每次10s，每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100L，37℃溫育40min，PBS洗滌4次，每次10s，加入底物溶液100L，37℃避光顯色15～20min，依序每孔加終止液100L，終止反應，在反應終止后5分鐘內用酶標儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。HIF-1α試劑盒由武漢華美生物科技有限公司所生產，VEGF試劑盒由Proteintech所生產。

1.4.2 相關性分析采用二元Logistic回歸分析成年SSHL患者經藥物聯(lián)合治療后血清HIF-1α、VEGF水平的變化與SSHL預后的相關性。首先對治療后HIF-1α和VEGF水平下降進行交叉表卡方檢驗，然后根據(jù)P值判斷是否需要進行二元logistic回歸分析。若P<0.05，則可進一步進行二元logistic回歸分析其是否與SSHL相關，若P>0.05，則說明其與SSHL不相關，不再進行二元logistic回歸分析?？ǚ綑z驗結果表明只有HIF-1α（P<0.05），可進行二元logistic回歸分析。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分，計數(shù)資料以［例（%）］表示，計量資料以mean±SD表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，將單因素分析中有統(tǒng)計學差異或接近統(tǒng)計學差異的指標（P<0.05）納入到二元Logistic回歸分析中，P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 31例患者經過藥物治療后的療效治療21d后，31例SSHL患者中痊愈患者12例（38.71%）、顯效患者7例（22.58%）及有效患者4例（12.90%），總體有效率計痊愈率、顯效率及有效率三者之和為74.19%；無效患者8例（25.81%），見表1。

表1 31例患者經過藥物治療后的療效［例（%）］

2.2 有效組患者與無效組患者治療前后血清HIF-1α、VEGF水平變化有效組患者治療后血清HIF-1α及VEGF水平較治療前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；無效組患者治療后血清HIF-1α及VEGF水平較治療前無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 有效組與無效組治療前后血清HIF-1α、VEGF比較（pg/mL）

2.3 成年SSHL預后的二元logistic回歸分析二元logistic回歸分析表明血清HIF-1α水平下降是SSHL預后的影響因素（P<0.05），見表3。

表3 SSHL預后的二元logistic回歸分析

3 討論

近年來，SSHL發(fā)病率有逐年遞增及年輕化的趨勢，不同程度的影響人們的身心健康及生活質量。該病為耳鼻咽喉科的一種常見急癥，根據(jù)流行病學調查研究顯示，其發(fā)病率在人群中約為0.05～0.2‰［7］，因我國地廣人多且各地醫(yī)療水平差異較大，該病真實發(fā)病率很有可能被低估。目前SSHL的發(fā)病機制因尚未完全明確，局部因素和全身因素均可能導致其發(fā)生，據(jù)文獻報道［8］兒童SSHL的主要病因為病毒感染，而成人SSHL則是以內耳微循環(huán)障礙為主。根據(jù)2015年指南［1］指示，SSHL發(fā)病3周以內屬于急性發(fā)作期，該階段多為內耳血管病變所致，建議采用糖皮質激素+血液流變學聯(lián)合治療。本研究中31例成年SSHL患者經藥物聯(lián)合治療后總體有效率為74.19%，其中有效組患者經藥物聯(lián)合治療后聽力明顯好轉甚至痊愈，提示其內耳微循環(huán)中急性缺血缺氧情況緩解，從而聽覺功能恢復。

HIF-1α是一種缺氧誘導的DNA結合蛋白，在機體缺氧狀態(tài)下，HIF-1α的羥化反應受抑制，從而降解減少并在細胞內積聚，HIF-1α的表達能夠增強細胞的抗凋亡能力和氧化應激能力、提高細胞生存力［9］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，成年SSHL患者發(fā)病過程中內耳微循環(huán)障礙所致的急性缺血缺氧病理狀態(tài)可引起血清HIF-1α水平升高，這提示HIF-1α可以一定程度上反映SSHL患者急性缺血缺氧的狀態(tài)。有研究表明［10］，腦梗死患者通過舒血寧治療后腦組織功能改善且血清HIF-1α水平較治療前下降，并且通過舒血寧+胞磷膽堿鈉聯(lián)合治療后患者預后水平提升，同時血清HIF-1α水平的下降程度較單一治療更為明顯，這提示擴張血管、改善微循環(huán)的治療方案不僅可以促進急性缺血缺氧后腦組織功能的恢復，還可影響血清HIF-1α水平變化，且該變化與治療效果及預后水平密切相關。舒血寧作為一種血小板活化因子受體抗結劑，具有擴張血管、改善微循環(huán)的作用，不僅廣泛用于腦缺血相關疾病，也是SSHL的常用藥物之一［11］、［12］。它可以改善SSHL患者內耳微循環(huán)急性缺血缺氧病例環(huán)境，使缺氧誘導的HIF-1α被羥化酶羥基化修飾，再通過泛素化-蛋白酶體途徑被降解，最終表現(xiàn)為治療有效的SSHL患者血清HIF-1α水平較治療前下降。這提示，HIF-1α可通過實時反映機體缺氧情況從而間接提示SSHL患者治療效果及病情變化。

VEGF屬于HIF-1α調控的下游靶基因之一，并在血管紋、螺旋神經節(jié)、螺旋韌帶和Corti器等內耳組織上均有表達［5］。研究表明，HIF-1α－VEGF反應軸在調節(jié)內耳新生血管生成過程中具有十分重要的作用，兩者在改善內耳微循環(huán)的過程中可能具有協(xié)同作用。當SSHL患者機體缺氧狀態(tài)改善后，HIF-1α表達下降，其下游靶基因VEGF的轉錄表達水平也隨之下降。有研究發(fā)現(xiàn)長春西汀可明顯改善老年血管性癡呆癥患者的認知功能，并調節(jié)HIF-1α及VEGF水平，分析原因可能是該藥物能夠增強缺血區(qū)的正常腦血流量，有效改善缺血缺氧狀態(tài)，增強大腦對局部缺氧環(huán)境的耐受力，并調節(jié)HIF-1α及 VEGF 的表達［13］。此外，有研究者在缺氧預處理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促進血管再生的實驗中發(fā)現(xiàn)，在HIF-1α被抑制后，VEGF的表達亦出現(xiàn)了顯著降低［14］。這提示，SSHL患者內耳微循環(huán)障礙所致的缺血缺氧病理狀態(tài)可通過HIF-1α-VEGF反應軸被更為具體地反映出來，該反應軸的變化可為評估SSHL病情嚴重程度及轉歸情況提供新的指導意義。

本研究還發(fā)現(xiàn)血清HIF-1α的變化與 SSHL預后密切相關。筆者認為，血清HIF-1α水平下降間接反映了SSHL患者通過擴血管、改善循環(huán)等綜合藥物治療，一定程度上糾正了機體缺血缺氧病理環(huán)境，內耳功能細胞恢復供氧，繼而聽力提高。據(jù)文獻報道，預后不佳的患者往往存在以下幾種原因：①就診時間過晚：內耳微循環(huán)長時間缺血缺氧導致內皮細胞結構及功能破壞，無法被HIF-1α－VEGF反應軸所調節(jié)并啟動缺氧保護機制，從而導致毛細胞及聽神經不可逆性損傷［15］；②內耳微循環(huán)血栓形成或栓塞：此類患者無法通過單純的擴張血管、改變血液流變學等手段及時糾正栓塞狀態(tài)，應早期溶栓治療；③椎－基底動脈系統(tǒng)相關動脈的硬化或狹窄：有學者報道椎基底動脈缺血患者發(fā)生突發(fā)性聾的概率增加［16］，更有學者指出腦卒中的多種危險因素是血管性急性聽力損失恢復不良的預后因素［17］。以上幾種預后不佳的情況均存在缺氧環(huán)境未糾正的情況，因而血清HIF-1α水平下降較不明顯。此外，研究發(fā)現(xiàn)血清VEGF的變化水平與SSHL預后關系不大，分析原因可能是：VEGF作為HIF-1α的下游靶基因之一，并非直接受氧環(huán)境所調控，而是通過HIF-1α水平變化間接地被促進或抑制表達。但受HIF-1α調控的下游靶基因眾多，其中在缺血缺氧損傷后可發(fā)揮神經保護作用的靶基因通路主要有：VEGF、促紅細胞生成素、細胞基質衍生因子-1、誘導型一氧化氮合酶和葡萄糖轉運蛋白1等［18］。機體氧環(huán)境的變化可雙向調節(jié)HIF-1α轉錄水平，進而作用于上述不同的靶基因，使組織產生缺氧適應并進一步促進機體功能的恢復。因而筆者分析，VEGF作為HIF-1α的下游靶基因之一，其變化受其他網(wǎng)狀靶基因通路的影響，其水平變化不如HIF-1α顯著，無法像HIF-1α較敏捷的隨機體的缺氧程度實時變化，較早在機體中反映出來，因而與SSHL預后關系不顯著。

檢測SSHL患者治療前后血清HIF-1α、VEGF水平及其變化程度，或許可以提示病情的轉歸過程及預后水平，而HIF-1α、VEGF在內耳中的表達機制還需要進一步的深入研究，以期為臨床預防及治療SSHL提供新思路。本研究樣本數(shù)量較小，還須擴充樣本量，深入分析論證。