TGF-β、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激cross-talk在肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 機制中的作用

王 濤，高 峰，王 瑞，米麗麗，張澤峰

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸一科，石家莊 050000）

肺癌是常見惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，近年來肺癌發(fā)病呈逐年增長趨勢，早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療是控制肺癌進展關(guān)鍵［1］。由于肺癌早期癥狀不典型，引起肺癌早期診斷困難，導(dǎo)致部分患者確診時已是肺癌中晚期，甚至出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，嚴重增加臨床治療難度和影響患者臨床預(yù)后［2］。肺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與上皮細胞間質(zhì)化（EMT）存在密切關(guān)系，EMT是指在某些特定的情況下上皮細胞的生理、病理狀態(tài)以及細胞形態(tài)向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，細胞間的附著能力減弱，更容易轉(zhuǎn)移［3］。轉(zhuǎn)移生長因子β（TGF-β）家族是一類具有旁分泌和自分泌功能的細胞因子，具有5類亞型并參與細胞多種生理功能。TGF-β1可廣泛分布于細胞、組織器官中，已有研究［4-5］表明口腔鱗狀細胞癌組織中心和浸潤前沿均呈高表達，與腫瘤浸潤深度和神經(jīng)侵犯呈正相關(guān)，還能促進宮頸癌細胞的侵襲和遷移，體外細胞實驗［6-8］表明TGF-β1還能誘導(dǎo)乳腺癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞EMT。腫瘤細胞EMT發(fā)生受到多種因素的影響，有研究表明［9］內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）可以參與腫瘤進展，誘導(dǎo)腫瘤細胞EMT、自噬，增強腫瘤細胞侵襲和耐藥。但有關(guān)TGF-β1、ER stress在肺癌EMT之間cross-talk的研究報道較少，本研究旨在探討TGF-β1和ER stress在肺癌細胞EMT中的cross-talk，希望為臨床肺癌藥物研發(fā)提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 實驗材料肺癌A549細胞系購自上海邦景實業(yè)有限公司。TGF-β1（純度>90%）購自南京歐凱生物。4-PBA（純度>98%）購自美國MedChemExpress LLC。絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）抗體購自武漢益普生物科技有限公司。兔抗人磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶（p-AKT）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、X盒集合蛋白1s（XBP-1s 1s）抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?。ECL Kit購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Gibco BRL。HRP標記羊抗兔二抗IgG、Trizol總RNA提取試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit購自上海翊圣生物科技有限公司。SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自上海滬震實業(yè)有限公司。Lightcycle 480實時定量PCR儀購自羅氏診斷。CO2培養(yǎng)箱購自美國REVCO。高速冷凍離心機購自美國Beckman Coulter。熒光顯微鏡購自德國徠卡。所用引物均有上?！どぬ峁?。

1.2 細胞培養(yǎng)肺癌A549細胞置于PRMI 1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素）37℃、5%CO2飽和濕度恒溫孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期，然后以1：4進行傳代培養(yǎng)，取第3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞分組和處理將肺癌A549細胞接種至滅菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件同1.2，待生長至60%時加入不同濃度的TGF-β1（0、2.5、5、10 ng/mL）［10］處理，繼續(xù)孵育24 h，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，細胞形態(tài)拉長且細胞間連接變得疏松說明細胞發(fā)生EMT。將肺癌A549細胞分為對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯(lián)合組，培養(yǎng)條件同上，待生長至60%時，待生長至60%時，TGF-β1組、4-PBA組、聯(lián)合組分別給予TGF-β1、4-PBA、TGF-β1+4-PBA處理，使其最終濃度分別為TGF-β1 10 ng/mL、4-PBA 10 mM、TGF-β1 10 ng/mL+4-PBA 10 mM，對照組給予等體積DMSO處理，繼續(xù)孵育24 h，用于后續(xù)實驗檢測。

1.4 transwell實驗將60μL Mateigel加入300μL無血清培養(yǎng)基混合均勻，加入100μL至上室膜包被，37℃孵育4 h，然后將1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯(lián)合組中的細胞接種至上室小孔（4×104/孔），下室加入600μL 含10%FBS培養(yǎng)基，作為趨化因子，1.2孵育條件繼續(xù)孵育24 h，棉簽擦除膜表層細胞，%甲醇固定底層細胞，%結(jié)晶紫染色20 min，高倍鏡下觀察5個不重疊視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)目，求其均值作為該組結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.5 Western-blot檢測蛋白表達提取1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯(lián)合組細胞總蛋白，Bradford調(diào)整各組提取蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人GRP78、XBP-1s、p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K、GAPDH抗體（1∶500）4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標記二抗（1：500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，曝光顯影，系統(tǒng)自帶軟件分析蛋白相對灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.6 RT-PCR檢測基因水平取1.3中對照組、TGF-β1組、4-PBA組、聯(lián)合組細胞，采用RNA純化試劑盒提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為PCR擴增模板，擴增程序設(shè)置為95℃預(yù)變形3min、95℃變性10s、56℃退火30s、72℃延伸10 s，34個循環(huán)，選用U6作為看家基因，使用2－ΔΔCt［11］法分析基因相對水平。重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件使用SPSS 22.0，柱狀圖繪制軟件采用GraphPad Prism 6.0，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示存在統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對肺癌A549細胞EMT的影響 TGF-β1處理下的肺癌A549細胞EMT形狀發(fā)生梭狀變化、細胞松散分布，隨著TGF-β1作用濃度升高，細胞散亂分布情況越明顯（圖1）。

圖1 各組細胞EMT情況

2.2 TGF-β1對肺癌A549細胞侵襲的影響 與對照組相比，TGF-β1組細胞侵襲數(shù)目升高（P<0.05），4-PBA組細胞侵襲數(shù)目降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯(lián)合組細胞侵襲數(shù)目降低（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組細胞侵襲情況

2.3 各組細胞EMT相關(guān)基因水平比較與對照組相比，TGF-β1組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平升高（P<0.05），E-cadherin mRNA水平降低（P<0.05）；與對照組相比，4-PBA組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯(lián)合組N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平降低（P<0.05），E-cadherin mRNA水平升高（P<0.05）（表1）。

表1 各組細胞EMT相關(guān)基因mRNA水平比較

2.4 各組細胞ER stress相關(guān)基因蛋白水平比較與對照組相比，TGF-β1組GRP78、XBP-1s蛋白水平升高（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平升高（P<0.05）。與對照組相比，4-PBA組GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯(lián)合組GRP78、XBP-1s蛋白水平降低（P<0.05），GRP78、XBP-1s mRNA水平降低（P<0.05）（圖3、表2）。

圖3 各組細胞GRP78、XBP-1s蛋白表達

表2 各組細胞ER stress相關(guān)基因蛋白水平比較（n=3）

2.5 各組細胞PI3K/AKT途徑相關(guān)蛋白水平與對照組相比，TGF-β1組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平升高（P<0.05），4-PBA組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）；與TGF-β1組相比，聯(lián)合組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平降低（P<0.05）（圖4、表3）。

圖4 各組細胞p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白表達

表3 各組細胞ER stress相關(guān)基因蛋白水平比較

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤首位［12］，腫瘤細胞EMT是惡性腫瘤出現(xiàn)侵襲、轉(zhuǎn)移的重要作用機理，腫瘤細胞通過EMT獲得間質(zhì)細胞形態(tài)和侵襲能力，可容易穿透基底膜進入腫瘤組織相鄰周圍組織，實現(xiàn)腫瘤細胞侵襲、遷移［13］。TGF-β1屬于具有自分泌、旁分泌功能的TGF-β超家族成員，可促進肝星狀細胞合成纖維連接蛋白、I型和IV型膠原，有利于細胞外基質(zhì)合成，同時還可通過增強Smad信號誘導(dǎo)肺癌細胞EMT［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TGF-β1作用劑量增加，肺癌A549細胞的EMT現(xiàn)象更加顯著，證實TGF-β1確實可以誘導(dǎo)肺癌A549細胞EMT。

EMT發(fā)生機制較為復(fù)雜，近年來有學(xué)者認為腫瘤細胞MET可能與腫瘤微環(huán)境有關(guān)，其中ER stress可參與腫瘤細胞EMT過程［15］。ER stress是指由各種因素引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊、錯誤折疊蛋白聚集，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，影響蛋白質(zhì)合成，使未折疊蛋白反應(yīng)激活［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予TGF-β1處理可以提高肺癌A549細胞的侵襲數(shù)目，而給予ER stress抑制劑4-PBA處理可以降低肺癌A549細胞侵襲數(shù)目，說明TGF-β1可以提高肺癌A549細胞的侵襲能力，給予ER stress抑制劑干預(yù)可以抵消部分TGF-β1促侵襲作用。本研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理能夠升高N-cadherin、vimentin、Snail1和Snail2 mRNA水平，降低E-cadherin mRNA水平，而4-PBA處理后上述指標的mRNA水平呈相反趨勢。E-cadherin對維持上皮細胞表型具有重要作用，可通過胞外的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域使各分子間產(chǎn)生相互連接，同時經(jīng)過胞內(nèi)α、β連接素和肌動蛋白骨架連接，最終形成穩(wěn)定的胞間接觸，E-cadherin表達異常直接影響細胞的粘附能力［17］。N-cadherin在調(diào)節(jié)細胞間的粘附能力方面呈現(xiàn)出相反趨勢，當惡性腫瘤出現(xiàn)侵襲、遷移，其表達量升高。Vimenti屬于中間絲蛋白質(zhì)，與微管、肌動蛋白微細絲共同組成細胞骨架。Snail是含有特殊結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，能識別E-cadherin啟動子并在E-box部位結(jié)合，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄。柳惠斌等［18］研究表明肺腺癌細胞TGF-β1陽性表達顯著，可以通過誘導(dǎo)細胞EMT增強細胞侵襲、遷移能力。本研究結(jié)果也出現(xiàn)趨勢，說明TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞EMT增強細胞的侵襲能力，同時也提示TGF-β1誘導(dǎo)肺癌A549細胞EMT作用機制可能與細胞的ER stress有關(guān)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞合成、加工、修飾蛋白以及鈣離子存儲場所，當受到自由基、藥物刺激、感染時，未折疊蛋白、錯誤折疊蛋白均會堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘發(fā)R stress。GRP78、XBP-1s是ER stress的標志性蛋白，在多種腫瘤組織中呈高表達，還與腫瘤的惡化程度、侵襲存在相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示TGF-β1處理可以提高GRP78、XBP-1s蛋白表達和基因水平，而給予4-PBA處理可以降低該趨勢。Shin等［19］研究表明4-PBA能夠降低TGF-β1誘導(dǎo)的ER stress標志物水平，本研究結(jié)果也出現(xiàn)相似趨勢，說明TGF-β1誘導(dǎo)的肺癌A549細胞EMT可能通過ER stress發(fā)揮作用。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理可以升高肺癌A549細胞的p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K蛋白水平，4-PBA處理趨勢相反。Ak、PI3K對抗細胞凋亡具有促進作用，已有研究［20］表明TGF-β1誘導(dǎo)細胞EMT是通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑實現(xiàn)的，本研究結(jié)果也呈相似趨勢，說明TGF-β1誘導(dǎo)腫瘤細胞EMT與影響PI3K/Akt信號通路活性有關(guān)。

綜上所述，本研究主要是通過細胞體外實驗證明TGF-β1可誘導(dǎo)肺癌A549細胞EMT，其一部分作用機制可能是通過介導(dǎo)ER stress發(fā)揮促EMT作用，而在動物體內(nèi)是否存在相似趨勢需要后續(xù)通過構(gòu)架突變體小鼠給予探索。