基于UPLC-MS/MS分析黑果枸杞中多糖的研究

李 晶，邢麗杰，王 遠(yuǎn)，羅瑞峰，盧士玲

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆石河子 832000；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)食品檢驗(yàn)所，新疆石河子 832000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr）.中含有許多的功能營(yíng)養(yǎng)成分，如花青素、多糖、礦物質(zhì)、多酚、有機(jī)酸和類胡蘿卜素等[1-4]，其中黑果枸杞多糖被認(rèn)為是黑果枸杞中最重要的功能物質(zhì)。多糖已被證實(shí)具有抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]、抗癌[8-9]、神經(jīng)保護(hù)[10]和抗衰老[11]等生物活性功能，此外多糖還能有效緩解疲勞、加速新陳代謝、控制血糖和保護(hù)視網(wǎng)膜[12-14]。

目前，測(cè)定多糖的方法包括高光譜成像法[15]、離子交換分離-脈沖安培法[16]、高效液相色譜法[17]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[18]。其中，高光譜成像法多用于總糖含量的測(cè)定；離子交換分離-脈沖安培法和高效液相色譜法可用于分離不同多糖，同時(shí)能定性定量；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多糖不需要衍生，且定性更加準(zhǔn)確。試驗(yàn)建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定黑果枸杞中蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖、甘露糖含量的方法，并對(duì)黑果枸杞多糖進(jìn)行分析測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖、甘露糖（純度大于99%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司提供；乙腈（色譜純），德國(guó)CNW公司提供；氨水（純度25%，優(yōu)級(jí)純）；黑果枸杞。

1.2 儀器與設(shè)備

QCA657型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（waters TQ-S），美國(guó)waters公司產(chǎn)品；ULPHW-IV型超純水儀，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品；KQ-600DE型超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HHS11-2型水浴鍋，金壇市精達(dá)儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHP-9082型烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 預(yù)處理

將干燥的黑果枸杞粉碎過(guò)60目篩，石油醚脫脂，料液比1∶3浸泡過(guò)夜，棄去石油醚，二次脫脂料液比1∶2，揮干石油醚，55℃下烘干，過(guò)篩60目篩，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及樣品處理

分別準(zhǔn)確稱取蔗糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、棉子糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg于10 mL容量瓶中，以50%乙腈為溶劑，配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的單個(gè)多糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；再分別移取適量10.0 mg/mL的單個(gè)多糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%乙腈溶液稀釋成1.0，10.0，50.0，100.0，200.0μg/mL質(zhì)量濃度的混合多糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

稱取1.00 g黑果枸杞樣品，經(jīng)30 mL 90℃熱水浸提，浸提60 min，然后再加入50 mL乙腈，用純水定容至100 mL，過(guò)0.22μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動(dòng)相A：0.1%氨水溶液，流動(dòng)相B：含0.1%氨水-乙腈溶液；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量3.0μL，柱溫35℃；梯度洗脫程序：0~10 min，20%~45%A；10~12 min，45%~45%A；12~12.01 min，45%~20%A，運(yùn)行時(shí)間15 min。

電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描，離子源溫度150℃，脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400℃，錐孔氣50 L/h，毛細(xì)管電壓2.5 kV。

7種多糖的離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 7種多糖的離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能量

2 結(jié)果與分析

采用UPLC-MS/MS法測(cè)定。

2.1 總離子流圖

由于多糖分子結(jié)構(gòu)中含有多羥基基團(tuán)，在離子化過(guò)程中易失去氫離子而形成負(fù)離子，所以采用電噴霧負(fù)離子源進(jìn)行離子化。在1.3.3中色譜和質(zhì)譜條件下，較好地分離黑果枸杞中鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、蔗糖和棉子糖等7種多糖。

7種單糖總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 7種單糖總離子流圖

2.2 線性范圍與檢出限

按1.3.2中配制7種多糖混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在1.3.3中色譜和質(zhì)譜條件下，以樣品的峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，μg/mL） 進(jìn)行線性擬合，同時(shí)按3倍RSN計(jì)算檢出限和10倍RSN計(jì)算定量限。7種多糖均在1.0~100.0μg/mL范圍呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，7種多糖的檢出限均為5 mg/kg，定量限均為10 mg/kg。

7種多糖的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)、檢出限見(jiàn)表2。

表2 7種多糖的線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用優(yōu)化后的UPLC-MS/MS法對(duì)黑果枸杞進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明黑果枸杞中檢出阿拉伯糖11.7 g/kg，葡萄糖35.4 g/kg，甘露糖未檢出，棉子糖1.4 g/kg，鼠李糖未檢出，果糖12.7 g/kg和蔗糖2.1 g/kg。

3 結(jié)論

建立了UPLC-MS/MS快速測(cè)定黑果枸杞中阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、果糖和蔗糖含量的方法，并應(yīng)用UPLC-MS/MS對(duì)黑果枸杞樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明7種多糖線性關(guān)系良好，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，適用于黑果枸杞中多糖的測(cè)定。