川陳皮素對麻醉后老齡認知功能障礙大鼠學習記憶功能損傷的改善作用

趙廣平，史炯，程晶晶，陳永學

(邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科，河北 邯鄲 056008)

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)為麻醉和手術后患者出現的中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥，患者在術后表現出人格、人際交往與認知學習能力障礙，主要為記憶力、集中力及話語理解力、社交能力較術前退化、受損，可在術后一段時間持續(xù)，部分并發(fā)癥持續(xù)時間甚至達數周，尤其對合并基礎疾病多的老齡患者預后較差。延長住院時間、重癥監(jiān)護室內滯留時間增加了術后并發(fā)癥的發(fā)生風險[1-2]，因此如何降低POCD發(fā)生率仍是目前臨床研究的重點之一。川陳皮素為中藥陳皮的主要成分之一，屬于多甲氧基黃酮類化合物，對乳腺癌、胃癌、肺癌及結腸癌等多種癌癥有抵抗作用，可抑制腫瘤血管生成，從而阻礙癌細胞增殖、侵襲、遷移并促進細胞凋亡[3-5]。川陳皮素還可預防動脈血栓形成，減輕糖尿病性心血管功能障礙[6]。核因子E2相關因子-2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)、血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO-1)為神經元細胞損傷后常見的氧化應激性指標；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12(caspase-12)是內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)通路重要調控蛋白，參與細胞凋亡的調控；環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)為特定的記憶調節(jié)基因；糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)則可調控神經細胞生長、增殖及凋亡。楊華等[7]報道川陳皮素可降低腦梗死大鼠低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)含量，提高血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，下調Cleaved caspase3蛋白表達而抑制神經細胞凋亡，據此推測川陳皮素可能對改善麻醉后認知功能障礙也有一定作用。因此，本文擬探討川陳皮素對麻醉后老齡認知功能障礙大鼠學習記憶功能的改善作用，以Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β、caspase-12為監(jiān)測的定量指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Sprague Dawley(SD)大鼠一般壽命為2.5～3年，依據人類60歲即為老年年齡的標準計算，SD大鼠進入老齡化時間約為1.7年，即20月齡。本次選取18～20月齡的健康雄性SD大鼠35只，體重470～540 g，平均(505.41±51.27)g，均由武漢大學動物實驗中心提供[SCXK(鄂)2014-004]，動物福利批次編號DWFL-201403005，依據該實驗中心的動物實驗倫理委員會相關規(guī)定進行實驗操作。SD大鼠均飼養(yǎng)于標準鼠籠，光照周期12/12 h光/暗循環(huán)，相對濕度45%～50%，溫度22～24 ℃，不間斷供給水、食物，適應性飼養(yǎng)1周使大鼠適應試驗環(huán)境方可開始實驗。

1.1.2 主要儀器與試劑 水平溫控搖床(XMOOOLDR-MLM，北京中西遠大科技有限公司)，體重稱、高速低溫離心機、電泳轉移槽與垂直電泳儀均由北京六一儀器廠生產，自動洗板儀(ELX50型，美國Bio-Tek Instruments Inc)，漩渦振蕩器(XW-80A型，上海精料實驗有限公司)，Morris水迷宮及分析軟件(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)，Fluor Chen5500凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Thermo公司)；1.5%異氟烷(江蘇恩華醫(yī)藥公司)，川陳皮素(陜西慧科生物科技有限公司)，β-actin抗體(北京中衫金橋生物技術公司，貨號：A-09)；兔抗Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β、caspase-12多克隆抗體(均購自美國KPL公司，貨號分別為A-AP52270、PAB4279、H00197259、QC999Hu01、WL03683、ABP50853)，抗體稀釋液(碧云天生物科技研究所)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳液粉劑(碧云天生物科技研究所)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京德萊生物科技有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 水迷宮預訓練 訓練實驗開始前，以500 g奶粉將水迷宮中的水混勻成乳白色，遮蔽圓形平臺。在適應性訓練開始前1 d，將大鼠置于水中自由游泳5 min，剔除不會游泳的大鼠。后將水迷宮中平臺露出水面，使動物可看見平臺，將動物放入池中，若大鼠毫無困難直接游向平臺則說明其視力正常，由此排除視力障礙對實驗結果的影響。由專門的實驗人員進行操作，實驗中保持環(huán)境安靜和穩(wěn)定，動物放入水中后立即離開，并維持水迷宮周圍物體位置及光源不變。通過預訓練的30只大鼠進入后續(xù)研究。

1.2.2 分組及建模 分組：水迷宮預訓練結束后第1天將30只大鼠隨機分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各6只。建立模型：禁食不禁水16 h后，在麻醉箱出氣口處檢測的異氟烷濃度維持在1.5%時，將模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的大鼠放置于麻醉誘導箱內隔板上部，麻醉生效時開始計時，連續(xù)吸入2 h濃度為1.5%的異氟烷。正常組吸入同樣時間的含30%氧氣的混合氣體。麻醉期間監(jiān)測出氣口處的異氟烷濃度，適時調整異氟烷揮發(fā)罐刻度，保持麻醉誘導箱中異氟烷氣體濃度恒定。麻醉生效標準：大鼠夾尾反射消失，此時開始計時并讓大鼠在麻醉環(huán)境中維持2 h。麻醉完全恢復標準：實驗大鼠從麻醉箱中取出后自然蘇醒且可在地板上穩(wěn)定自主地行走，記錄其時間，為后續(xù)實驗做參考。

1.2.3 川陳皮素注射方法 低劑量組、中劑量組、高劑量組分別腹腔內注射10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg川陳皮素，連續(xù)3 d，模型組及正常組經腹腔注射同等體積的吐溫-80，連續(xù)3 d。其中前2 d為麻醉實施前，第3天為麻醉完全恢復后2 h。注射藥物器具均滅菌消毒，注射時先回抽以避免注射針頭誤入血管內。

1.2.4 Morris水迷宮實驗 在異氟烷麻醉完全恢復24 h后，連續(xù)進行4 d的Morris水迷宮實驗。方法：將水池分為4個象限，依據順時針方向標記為Ⅰ～Ⅳ，水池及平臺均為黑色，平臺固定于第Ⅲ象限，將水池染成黑色以隱匿水下平臺，保持水溫26 ℃，打開計算機，確定設備及軟件工作正常，經自動圖像拍攝系統(tǒng)記錄游泳軌跡，以入水時找到平臺時間為潛伏期，測4次后取均值，評估其學習記憶能力。在第4天記錄各組大鼠在目標象限中停留時間及60 s內穿越平臺次數，測定空間探索功能，見圖1。

1.2.5 海馬組織取材及制片 水迷宮實驗結束后大鼠空腹過夜8 h。每組隨機選取4只大鼠進行心臟灌注，予以10%水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔注射麻醉(1%戊巴比妥鈉30 mg/kg)，開胸暴露心臟，進行左心室插管，后將右心耳剪開，快速完整取出全腦組織放入4%中性多聚甲醛灌注固定，并參考前人的研究方法分離海馬組織，以液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存待測。剪取1 mm3海馬組織，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，光鏡觀察。

1.2.6 Western blot試驗 采用Western blot試驗檢測海馬組織CA1區(qū)的Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β、caspase-12表達水平。組織蛋白試劑盒提取各組腦組織蛋白，經BCA法對總蛋白定量。取40 μg蛋白樣品于12%的SDS-PAGE分離，轉膜、封閉后孵育1∶1 000稀釋的一抗及GAPDH，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜(3×5 min)，二抗孵育(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀釋)，室溫孵育2 h，采用化學發(fā)光劑顯色，室溫下避光顯影，采用全自動數目凝膠成像分析系統(tǒng)(Image J)對蛋白條帶光密度進行測定并分析，相對表達量=目的蛋白灰度值/內參灰度值，連續(xù)測3次后取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗結果

隨時間延長，各組SD大鼠逃生潛伏期呈縮短趨勢，與正常組比較，模型組第1～3天逃生潛伏期延長(P<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組在第2 天、第3天逃生潛伏期短于模型組(P<0.05)，第4天中劑量組、高劑量組逃生潛伏期短于模型組(P<0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組的逃生潛伏期比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組在目標象限中停留時間、穿越平臺次數短低于正常組，低劑量組、中劑量組、高劑量組在目標象限中停留時間及穿越平臺次數高于模型組，中劑量組、高劑量組在目標象限中停留時間及穿越平臺次數高于低劑量組(P<0.05)，且中劑量組、高劑量組在目標象限中停留時間與正常組仍有差異(P<0.05)，而穿越平臺次數與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中劑量組、高劑量組的上述指標比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、表2、圖2、圖3。

表1 Morris水迷宮實驗-學習記憶能力

表2 Morris水迷宮實驗-空間探索功能指標

2.2 HE染色結果

光鏡下可發(fā)現，正常組的大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數目正常，排列緊密，胞漿內結構清晰，腦白質形態(tài)正常，模型組海馬CA1錐體細胞缺失脫失，排列疏松，部分細胞出現核固縮、深染色，腦白質無明顯梗死灶，部分白質纖維變稀疏且走行紊亂，低劑量組、中劑量組、高劑量組錐體細胞缺脫失程度小于模型組，腦白質未見梗死灶，白質纖維部分稀疏。見圖4、圖5。

2.3 Western blot結果

模型組海馬組織CA1區(qū)Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β、caspase-12水平高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β水平高于模型組，caspase-12低于模型組，其中高劑量組的變化最顯著(P<0.05)；低劑量組Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β低于中劑量組、高劑量組，而caspase-12高于中劑量組、高劑量組(P<0.05)；中劑量組與高劑量組的各指標比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖6、圖7。

3 討論

POCD為多種因素誘發(fā)及加重神經功能退行性改變引起的并發(fā)癥[8]，而老年人群中樞神經系統(tǒng)本身有不同程度退化，多數合并各種心腦血管疾病更易引起POCD，且近年來我國已初步進入老齡化社會，老年人口基數龐大，接受麻醉手術的老年患者增多，POCD發(fā)生率增多，早期進行預防、盡早識別并治療有著重要意義[9]。川陳皮素為從蕓香科柑桔屬橘子的果皮中提取出來的多甲氧基黃酮類化合物，有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、調節(jié)營養(yǎng)神經等[10-11]，近年來研究[12-13]也發(fā)現，川陳皮素有一定的保護腦屏障、抗阿爾茨海默病及帕金森病作用，但是川陳皮素對術后認知功能障礙的改善作用目前研究甚少。

異氟烷為最常用的吸入麻醉藥，臨床研究[14]表明1.4%及更高濃度的異氟烷麻醉6 h后可誘導廣泛的腦神經凋亡及認知功能下降，其機制可能與GSK-3β活性的增加有關。本次選擇異氟烷建立麻醉后老齡認知功能障礙大鼠模型，在水迷宮Morris實驗-學習記憶能力測試中發(fā)現，隨時間延長各組的逃生潛伏期呈下降趨勢，且模型組第1～3天逃生潛伏期較正常組高，予以低、中、高劑量川陳皮素的大鼠在第2天、第3天逃生潛伏期均短于模型組，而不同劑量的川陳皮素對逃生潛伏期無影響，表明川陳皮素可較好改善麻醉后認知功能障礙老齡大鼠的學習記憶能力，提高其認知功能，但未發(fā)現較明顯的劑量效應?？臻g探索功能部分中，模型組在目標象限中停留時間、穿越平臺次數短于正常組，川陳皮素給藥的三組在目標象限中停留時間及穿越平臺次數高于模型組，且以中劑量組、高劑量組的變化更為顯著，與張紅蕊等[15]報道結果相似，均表明川陳皮素可改善麻醉后認知功能障礙大鼠的空間探索功能，改善其認知功能。但既往Kang等[16]卻認為，川陳皮素可改善情緒和新奇識別記憶，但不能改善空間參照記憶，與本研究結論不一致，這可能與試驗選取的動物月齡及樣本量不同有關，即川陳皮素對不同種群的空間定位學習記憶能力的影響不同。

海馬為學習記憶的關鍵部位，其CA1及CA3區(qū)錐體細胞為形成記憶的長時程增強效應(long-term potentiation,LTP)重要區(qū)域，對異氟烷的麻醉濃度變化異常敏感，且海馬結構與學習記憶能力密切相關，當海馬結構功能受損時可導致認知功能障礙[17-18]。本次HE染色顯示，與其他各組相比，模型組海馬CA1錐體細胞缺失脫失，排列疏松，部分白質纖維變稀疏且走行紊亂，與柏慧[19]的觀察結果相近，表明在異氟烷麻醉后可引起老齡大鼠海馬組織損傷，但其作用機制仍待進一步分析。

Nrf-2屬于CNC家族，為家族中活性最強的轉錄因子，在正常情況下，Nrf-2被細胞質中Keap1錨定，其活性相對抑制，Keap1對氧化還原酶較敏感，有氧化應激時與Nrf-2解離，使其進入細胞核，在核內和抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)作用，啟動下游抗氧化蛋白，增強解毒素酶系的表達，如γ-GCS、HO-1等，清除大量自由基，減輕細胞損傷，而經下調膠質細胞活化介導對神經元的保護作用，此外內質網也易受機體內環(huán)境影響，在氧化應激時即可破壞內質網穩(wěn)定性，其中caspase-12為ERS通路的重要調控蛋白，手術或麻醉后可使ERS反應激活，活化的caspase-12能激活caspase-3、caspase-9而引起細胞凋亡[20]。本研究發(fā)現，模型組海馬組織CA1區(qū)Nrf-2、γ-GCS、HO-1、caspase-12高于正常組，川陳皮素給藥的三組Nrf-2、γ-GCS、HO-1也高于模型組，而caspase-12則低于模型組，其中高劑量組的變化最顯著，與田玉娜等[21]研究結果相似，表明川陳皮素可有效改善麻醉后老齡大鼠認知功能及海馬組織神經元結構，上調Nrf2、γ-GCS、HO-1的表達，下調caspase-12的表達，抑制海馬組織凋亡，其機制可能與增強Nrf-2活性及激活抗氧化應激通路有關。在麻醉后創(chuàng)傷環(huán)境下，對氧化應激敏感的Keap1即釋放Nrf-2入細胞核，Nrf-2活性增強、表達量增多，啟動下游抗氧化蛋白(如γ-GCS、HO-1等)表達，中和大量氧化應激產物、神經元毒素等，以保護海馬神經元，但仍不能抵抗麻醉損傷導致的氧化應激，因此海馬損傷使大鼠出現認知功能障礙，經川陳皮素治療的麻醉后老齡大鼠認知功能有所改善，海馬Nrf-2表達水平較異氟烷麻醉者高，進而推測川陳皮素可能為Nrf-2的激活劑，可誘導Nrf-2活性增強、表達量增多，繼而產生更多的抗氧化蛋白以保護海馬結構，激活Nrf-2-ARE信號通路的抗氧化作用，因此川陳皮素對麻醉后老齡大鼠的認知功能障礙有一定治療作用。

CREB為特定的調節(jié)記憶基因，可經cAMP和/或Ca2+通過各種蛋白激酶在Ser133磷酸化而激活核中的CREB信號，從而改變認知功能。GSK-3β為一種絲氨酸/酸酸蛋白激酶，對神經細胞生長、增殖及凋亡有重要調控作用。早期研究[22]發(fā)現，通過川陳皮素治療可增加CREB信號傳導而挽救亞硝基-谷胱甘肽還原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)誘導衰老過程中的神經衰老。本次模型組海馬組織CA1區(qū)CREB、GSK-3β水平高于正常組，川陳皮素給藥的三組CREB、GSK-3β水平高于模型組，其中高劑量組的變化最顯著，表明川陳皮素可通過增加老齡大鼠的海馬體中CREB/GSK-3β依賴性的信號傳導途徑，減輕麻醉后海馬神經元損傷，改善其認知功能。早期Bi等[23]也報道，川陳皮素有抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，川陳皮素可通過激活磷酸化磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-akt，P-Akt)、CREB及腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)蛋白表達，降低B細胞淋巴瘤2相關X蛋白水平，改善衰老大鼠由異氟烷誘導的認知障礙。Zhang等[24]的研究也發(fā)現，川陳皮素可通過抑制表達Slug的神經膠質瘤細胞中AKT/GSK3beta/β-catenin信號傳導途徑來抑制侵襲。畢俊英[25]發(fā)現，川陳皮素可改善老年大鼠麻醉后學習記憶功能的損害，且大劑量川陳皮素的改善作用更明顯，其可能是通過調節(jié)PI3K/Akt-核轉錄因子κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路所介導的中樞神經系統(tǒng)內炎癥反應及氧化應激反應來實現的。以上研究均表明激活CREB/GSK-3β通路可能也是川陳皮素減輕老齡大鼠麻醉后認知功能障礙的機制。

綜上所述，川陳皮素可能通過激活Nrf-2、γ-GCS、HO-1、CREB、GSK-3β的表達增強抗氧化應激，減少caspase-12的表達抑制凋亡，進而改善麻醉后老齡認知障礙大鼠的學習記憶功能。