新型腫瘤靶標(biāo)環(huán)狀RNA的研究進(jìn)展

徐 昊，方夢(mèng)蝶，李 超，劉 宸，任 娟，張衍梅

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)中心，杭州 310013

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是共價(jià)連續(xù)的閉合環(huán)狀體，不具有5’和3’端，這使其結(jié)構(gòu)比線性RNA更加穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解[1]。起初circRNA被認(rèn)為是錯(cuò)誤剪接的產(chǎn)物[2]，或從內(nèi)含子的套索結(jié)構(gòu)中逃逸的中間產(chǎn)物。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)的廣泛應(yīng)用，眾多研究發(fā)現(xiàn)circRNA是一類內(nèi)生的、數(shù)量眾多的、穩(wěn)定存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的分子，具有一定的組織、時(shí)序和疾病特性[3]，不再被認(rèn)為是一類在人體中無(wú)作用的RNA分子[4]。circRNA存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，正常人體中有超過(guò)400種circRNA，其表達(dá)異常可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[5-6]。circRNA具有miRNA海綿功能，富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以解除miRNA對(duì)靶基因的抑制作用，進(jìn)而升高靶基因表達(dá)水平，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，被稱為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)機(jī)制[7]。例如乳腺癌中的hsa_circ_0072309(circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中的ID號(hào))通過(guò)miRNA海綿功能調(diào)控miR-492，影響乳腺癌發(fā)生[8]。circRNA因其特性和生物學(xué)功能被認(rèn)為是一種新型潛在腫瘤標(biāo)志物，Zeng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA作為結(jié)直腸癌潛在腫瘤標(biāo)志物具有較高的診斷價(jià)值，circHIPK3是結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的潛在腫瘤靶標(biāo)。本文總結(jié)了近年來(lái)circRNA在癌癥中的研究進(jìn)展，包括circRNA的發(fā)生機(jī)制、功能、數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容和研究方法，以及在腫瘤中的應(yīng)用研究。

circRNA發(fā)生機(jī)制

Sanger等[2]于1976年發(fā)現(xiàn)了一些單鏈共價(jià)閉合的植物病毒，為circRNA研究奠定了基礎(chǔ)，此后越來(lái)越多的circRNA逐漸被人們發(fā)現(xiàn)[10-12]。1個(gè)基因可以產(chǎn)生多種不同的circRNA，甚至有些circRNA的表達(dá)量高于其對(duì)應(yīng)的母基因線性RNA。大多數(shù)circRNA是由外顯子形成的，也有少數(shù)是以內(nèi)含子或外顯子-內(nèi)含子的形式成環(huán)的，成環(huán)的機(jī)制主要是反向剪接[13]。circRNA的種類包括：僅外顯子來(lái)源的circRNA；上下游外顯子反向剪接且保留內(nèi)含子的外顯子-內(nèi)含子circRNA；以及僅內(nèi)含子來(lái)源的circRNA[4]。大多數(shù)circRNA是外顯子來(lái)源的，且由1個(gè)或多個(gè)外顯子構(gòu)成，并且反向剪接最小需要1個(gè)外顯子的長(zhǎng)度。有研究顯示，在高表達(dá)的circRNA中，單外顯子circRNA的外顯子比多外顯子circRNA的外顯子長(zhǎng)的多[14]。各種來(lái)源的circRNA主要由反向剪接形成，在形成過(guò)程中也會(huì)受到順式和反式調(diào)控[15]。

circRNA形成的剪接方式導(dǎo)致circRNA形成的拼接位點(diǎn)大多為經(jīng)典的適用于mRNA可變剪切的位點(diǎn)。已有研究利用circRNA表達(dá)載體中的突變分析，以及利用剪接抑制劑處理后阻斷剪接體裝配，表明circRNA的生物發(fā)生依賴于經(jīng)典的剪接機(jī)制[16-17]。當(dāng)mRNA前體加工事件變慢，新生的RNA會(huì)被導(dǎo)向另外一條路，即促進(jìn)反向剪接，導(dǎo)致circRNA形成[18]。一部分circRNA來(lái)自編碼或非編碼基因，可通過(guò)外顯子跳躍等方式進(jìn)行剪接，且受到細(xì)胞類型特異性調(diào)控[19]；另一部分circRNA通過(guò)內(nèi)含子保留的方式形成外顯子-內(nèi)含子circRNA。內(nèi)含子保留是低等真核生物和人類基因中常見的選擇性剪接調(diào)控形式，最近被發(fā)現(xiàn)是一種普遍且受調(diào)控的現(xiàn)象[20-22]。線性轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子保留是由多細(xì)胞生物剪接機(jī)制產(chǎn)生的，所以有些circRNA中同樣保留內(nèi)含子。RNA-seq技術(shù)和Northern雜交等證據(jù)表明，circRNA受到細(xì)胞類型的特異性調(diào)控[19]。

circRNA的形成還依賴于一些非經(jīng)典的剪接信號(hào)[23]。內(nèi)含子circRNA是套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的，經(jīng)過(guò)外顯子跳躍后形成套索中間體，依賴于5’端剪接位點(diǎn)的GU和C堿基富集基序，經(jīng)過(guò)聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄和磷酸二酯鍵共價(jià)連接而環(huán)化，3’端的多余序列被降解，最終形成成熟的circRNA[24]。

circRNA形成的順式和反式調(diào)控

順式調(diào)控：circRNA的形成過(guò)程中，位于上游和下游內(nèi)含子中的反向重復(fù)元件之間的堿基配對(duì)介導(dǎo)下游剪接供體位點(diǎn)和上游剪接受體位點(diǎn)側(cè)翼的內(nèi)含子序列接近和環(huán)化[16，25]。在小鼠的Y染色體性別決定區(qū)(sex-determining region of Y-chromosome，sry)研究中發(fā)現(xiàn)，circRNA的形成由順式作用元件調(diào)控，受到circRNA兩側(cè)的反向重復(fù)序列調(diào)控[26]。含有互補(bǔ)性Alu重復(fù)序列的Alu元件介導(dǎo)外顯子環(huán)化[7]。此外，在線蟲和人中都發(fā)現(xiàn)circRNA的側(cè)翼內(nèi)含子上富集反向互補(bǔ)配對(duì)序列(reverse complementary matches，RCMs)[27]。因此參與circRNA環(huán)化的剪接位點(diǎn)側(cè)翼內(nèi)含子中特定的順式作用元件調(diào)控circRNA的形成。有研究表明，小于100 nt的微型內(nèi)含子只要含有30 nt及以上的反向互補(bǔ)重復(fù)序列，就可以促進(jìn)外顯子環(huán)化[28]。circRNA側(cè)翼內(nèi)含子富含RCMs、內(nèi)含子互補(bǔ)序列(intronic complementary sequences，ICSs)及Alu元件，這些元件對(duì)circRNA的環(huán)化有促進(jìn)作用[29-30]。其中Alu元件是驅(qū)動(dòng)circRNA成環(huán)的重要基礎(chǔ)，也是預(yù)測(cè)和分析circRNA的重要元件[31]。

反式調(diào)控：然而僅順式作用元件不足以解釋circ-RNA復(fù)雜的形成機(jī)制，RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)可結(jié)合內(nèi)含子側(cè)翼序列上的順式作用元件調(diào)控circRNA形成。例如：果蠅中蟲漆酶2(laccase2，lcc2)基因來(lái)源的circRNA受到異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)以及SR蛋白(serine/arginine-rich protein，SRp)的共同調(diào)節(jié)，提示外顯子的環(huán)化效率可能受多種蛋白調(diào)控[32]。有研究者提出，震顫蛋白(quaking，QKI)作為RNA結(jié)合蛋白，在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中能夠結(jié)合到側(cè)翼內(nèi)含子特定的結(jié)構(gòu)域上，促進(jìn)外顯子環(huán)化[33]。RNA特異性腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA，ADAR)是雙鏈RBP，可使腺苷脫氨而編輯RNA，研究發(fā)現(xiàn)敲低ADAR1可顯著上調(diào)circRNA的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)側(cè)翼內(nèi)含子上的ICS以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方式介導(dǎo)外顯子環(huán)化[27]。然而，目前少有研究證明反式作用因子與前體mRNA直接產(chǎn)生相互作用[34]。

circRNA的生物學(xué)功能

circRNA功能多樣，由于其富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，因此常被發(fā)現(xiàn)具有miRNA海綿功能。此外circRNA亦有調(diào)控母基因表達(dá)，調(diào)控母基因選擇性剪接，翻譯蛋白的功能。

miRNA海綿功能通過(guò)miRNA應(yīng)答元件，非編碼RNA和編碼RNA在轉(zhuǎn)錄組中形成了大規(guī)模的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miRNA是基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，降低靶基因的穩(wěn)定性或限制其翻譯功能[35]。circRNA富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，是一類新的表達(dá)量高、穩(wěn)定性強(qiáng)的ceRNA[36]。circSRY和CDR1as(ciRS-7)是最先被證明具有miRNA海綿功能的circRNA，與miRNA結(jié)合而不被降解使其成為有效的ceRNA分子[37-39]。circSRY上有16個(gè)miR-138的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)miR-138過(guò)表達(dá)時(shí)，circSRY可以與真核翻譯起始因子2C2(argonaute 2，AGO2)共沉淀，而當(dāng)circSRY過(guò)表達(dá)時(shí)，miR-138的作用減弱[40-42]；同樣地，ciRS-7上含有70個(gè)以上的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，AGO免疫沉淀結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)結(jié)果分析證明，ciRS-7可與miR-7相互作用，進(jìn)而抑制miR-7的活性，導(dǎo)致靶基因表達(dá)水平上調(diào)，其原因與ciRS-7捕獲了胞質(zhì)中大量miR-7有關(guān)[12，40，43]。

(5)預(yù)裂爆破、梯段爆破和特殊部位的爆破，其參數(shù)和裝藥量應(yīng)遵守DL/T5389-2007《水工建筑物巖石基礎(chǔ)開挖工程施工技術(shù)規(guī)范》第8章規(guī)定的要求。

調(diào)控母基因表達(dá)circRNA可與RNA相互作用參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。circRNA形成過(guò)程中，內(nèi)含子間競(jìng)爭(zhēng)性互補(bǔ)配對(duì)與線性RNA之間保持平衡，從而影響mRNA的表達(dá)與翻譯。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲低ci-ankrd52等內(nèi)含子來(lái)源的circRNA時(shí)，其對(duì)應(yīng)的母基因表達(dá)也顯著降低，說(shuō)明circRNA對(duì)于其母基因的表達(dá)有順式作用。此外，Lu等[44]通過(guò)過(guò)表達(dá)水稻中circRNA發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)母基因的表達(dá)減少，證明circRNA與其線性轉(zhuǎn)錄本可能是母基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子。

通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ和表觀遺傳修飾調(diào)控母基因。某些來(lái)源于內(nèi)含子的circRNA主要定位于細(xì)胞核中，能夠與RNA聚合酶Ⅱ相互作用促進(jìn)自身編碼基因轉(zhuǎn)錄[1]。circRNA還能通過(guò)表觀遺傳修飾來(lái)調(diào)控母基因的表達(dá)。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾普遍存在于高等生物mRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)上，近來(lái)發(fā)現(xiàn)某些circRNA也存在m6A修飾，該circRNA會(huì)影響母基因的穩(wěn)定性[45]。由此可見，circRNA可被用于調(diào)控疾病相關(guān)母基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響母系基因及其靶基因的表達(dá)，為相應(yīng)疾病的治療提供新思路。

與RNA結(jié)合蛋白相互作用circRNA可以通過(guò)與RBP結(jié)合，進(jìn)而改變剪接模式或RNA的穩(wěn)定性。人類盲肌蛋白(muscleblind，MBL)是人類盲肌樣蛋白1(muscleblind-like 1，MBNL1)的同源物，MBL促進(jìn)circMbl的生成，circMbl上存在特異的MBL結(jié)合位點(diǎn)，且circMbl與MBL蛋白有強(qiáng)烈的直接相互作用[25]。circMbl可以調(diào)節(jié)MBL蛋白水平，當(dāng)MBL過(guò)量時(shí)，它通過(guò)促進(jìn)circMbl產(chǎn)生來(lái)降低自身mRNA產(chǎn)量。circMbl也可以通過(guò)結(jié)合MBL來(lái)消除多余的MBL[16]。circRNA通過(guò)與相關(guān)蛋白結(jié)合，可以促進(jìn)DNA、RNA、RBP間的相互作用，發(fā)揮生物學(xué)功能[46]。

調(diào)節(jié)選擇性剪接circRNA通常來(lái)源于蛋白質(zhì)編碼基因中的外顯子，所以circRNA形成對(duì)前體mRNA的可變剪接能夠產(chǎn)生調(diào)控作用[7]。Ashwal-Fluss等[16]研究發(fā)現(xiàn)，circMbl是由剪接因子MBL基因的第2個(gè)外顯子產(chǎn)生，它自身成環(huán)的剪接與普通的pre-mRNA剪接競(jìng)爭(zhēng)，MBL蛋白水平調(diào)節(jié)顯著影響了circMbl形成，MBL通過(guò)調(diào)節(jié)circRNA的生物發(fā)生，對(duì)經(jīng)典剪接和選擇性剪接之間的平衡產(chǎn)生影響。外顯子跳躍是pre-mRNA最常見的選擇性剪接事件，理論上來(lái)說(shuō)circRNA形成與線性mRNA的外顯子跳躍事件呈正相關(guān)[47]。這表明circRNA的生物發(fā)生對(duì)相應(yīng)線性mRNA產(chǎn)生經(jīng)典剪接和選擇性剪接有著重要作用。

蛋白翻譯通常circRNA是不能被翻譯的，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)一些circRNA的外顯子序列可以被翻譯成蛋白質(zhì)。有些circRNA包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)序列，并能直接與核糖體結(jié)合，可以在真核細(xì)胞中翻譯[48]。真核核糖體的40S亞基與circRNA結(jié)合，可直接啟動(dòng)翻譯[49]。在具有開放閱讀框(open reading frame，ORF)的大腸桿菌無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中，circRNA也可以有效翻譯[50]。也有研究表明，真核內(nèi)源性circRNA可通過(guò)m6A甲基化來(lái)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)翻譯[51]。

circRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)

常用的circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)包括circBase、CSCD、circInteractome和circFunBase等。這些不同的數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋不同物種中circRNA的信息(表1)，包括circRNA對(duì)應(yīng)的染色體區(qū)域上重復(fù)元件、亞細(xì)胞定位、可否翻譯、RBP以及miRNA之間的調(diào)控和相互作用、與人類疾病或性狀的相關(guān)性等。

表1 circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比較Table 1 Comparison of databases for circRNA

CSCDCSCD是癌癥特異circRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)，從ENCODE中收集了腫瘤組織和正常組織細(xì)胞系的circRNA數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)可以預(yù)測(cè)circRNA上的miRNA反應(yīng)元件位點(diǎn)以及RBP的結(jié)合位點(diǎn)，circRNA的亞細(xì)胞定位，以及潛在的ORF，用來(lái)研究可翻譯circRNA。該數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供線性剪接和反向剪接之間的比較信息，預(yù)測(cè)circRNA線性轉(zhuǎn)錄本的剪接事件[53]。

circInteractomecircInteractome數(shù)據(jù)庫(kù)主要用于研究circRNA與RBP以及miRNA之間的調(diào)控和相互作用。該數(shù)據(jù)庫(kù)集合了目前已知的RBP，分析它們與circRNA的結(jié)合位點(diǎn)，還利用軟件對(duì)circRNA和miRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，該數(shù)據(jù)庫(kù)還能設(shè)計(jì)circRNA的qPCR引物，也可以查詢沉默circRNA的siRNA序列，幫助研究者設(shè)計(jì)siRNA[54]。

circFunBasecircFunBase數(shù)據(jù)庫(kù)記錄了從PubMed中收集整合所得的7000多個(gè)功能性circRNA，主要包括人、鼠等。該數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供可視化的circRNA-miRNA交互網(wǎng)絡(luò)，以及circRNA的基因組背景。該數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)于circRNA的注釋較為全面，包括了位置、組織、表達(dá)模式、功能、基因描述等，對(duì)于人源的circRNA還提供了互作miRNA和RBP[55]。

其他常用circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)circ2Traits對(duì)miRNA與circRNA、lncRNA和人類蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，還對(duì)circRNA的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)進(jìn)行定位與分析[56]。starBase數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)分析已發(fā)表的circRNA數(shù)據(jù)，構(gòu)建miRNA-circRNA以及circRNA-RBP的互作網(wǎng)絡(luò)，還展示了RBP與體細(xì)胞突變之間的潛在聯(lián)系[57]。利用通過(guò)RNA-seq得到的測(cè)序數(shù)據(jù)，circNet對(duì)circRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其基因組進(jìn)行注釋，該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了circRNA-miRNA-gene的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且對(duì)circRNA在不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行了注釋[58]。circRNADb數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了人類circRNA，只包含外顯子反向剪接后產(chǎn)生的circRNA，除了染色體位置、序列等基本信息外，還注釋了蛋白編碼潛能等信息[59]。

circRNA的主要研究方法

qPCR檢測(cè)circRNA的表達(dá)對(duì)circRNA進(jìn)行qPCR可以對(duì)circRNA進(jìn)行鑒定和表達(dá)差異分析，是高通量測(cè)序篩選后驗(yàn)證的必要步驟。對(duì)circRNA進(jìn)行qPCR需要提取樣本RNA并使用RNase R處理以富集circRNA，隨后利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并利用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。采用PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和Sanger測(cè)序進(jìn)一步鑒定circRNA序列，根據(jù)擴(kuò)增曲線、溶解曲線等參數(shù)進(jìn)行circRNA的表達(dá)量分析[60]。circRNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)需要兩對(duì)引物：Divergent primer和Convergent primer。Divergent primer擴(kuò)增和跨越circRNA的拼接位點(diǎn)，即便在相應(yīng)線性RNA存在的情況下，也能特異性檢測(cè)circRNA。Divergent primer擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng)，短的擴(kuò)增子將會(huì)增強(qiáng)拼接位點(diǎn)處的擴(kuò)增效率[61]。Convergent primer用來(lái)驗(yàn)證成環(huán)方向，且可檢測(cè)母基因的表達(dá)量。

熒光原位雜交檢測(cè)circRNA的亞細(xì)胞定位circRNA在亞細(xì)胞定位上呈現(xiàn)多樣化，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中均有circRNA的分布，甚至某些circRNA具有獨(dú)特的亞細(xì)胞定位，可能是全新的亞細(xì)胞構(gòu)成。circRNA細(xì)胞定位是決定其調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。如果該circRNA主要定位于細(xì)胞質(zhì)，則可能為ceRNA。運(yùn)用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)對(duì)目標(biāo)circRNA進(jìn)行定位，以便于后續(xù)功能的進(jìn)一步研究，需要注意的是設(shè)計(jì)的雜交探針需要跨越環(huán)化的拼接位點(diǎn)[62]。

circRNA過(guò)表達(dá)過(guò)表達(dá)通常用于研究某個(gè)基因表達(dá)量增高后的生物學(xué)效應(yīng)?；赾ircRNA的成環(huán)機(jī)制大多與成環(huán)外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子側(cè)翼序列中的重復(fù)元件有關(guān)(如Alu元件)。circRNA過(guò)表達(dá)可通過(guò)克隆包括Alu元件或反向互補(bǔ)配對(duì)序列的circRNA序列至真核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞提高circRNA的表達(dá)量。對(duì)載體的改造包括添加GFP綠色熒光蛋白標(biāo)記或抗性標(biāo)記，也可滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求[63]。

pull-down技術(shù)檢測(cè)circRNA互作因子研究circRNA的互作因子是探究其功能的重要方向，circRNA主要與miRNA或蛋白產(chǎn)生相互作用。利用與circRNA剪接位置互補(bǔ)的生物素標(biāo)記探針，對(duì)circRNA結(jié)合的分子復(fù)合物進(jìn)行捕獲。利用qPCR或者高通量測(cè)序鑒定結(jié)合的miRNA分子，而結(jié)合的蛋白則用Western雜交進(jìn)行分析。circRNA pull-down技術(shù)有利于鑒定circRNA的互作因子，驗(yàn)證其miRNA海綿功能等生物學(xué)功能[64]。

其他生物學(xué)方法Northern雜交可依次對(duì)總RNA、基因組DNA和已經(jīng)消化掉DNA、核糖體RNA、線性RNA的總RNA進(jìn)行雜交，驗(yàn)證circRNA的序列[65]。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)載體和帶有GFP標(biāo)記蛋白的載體等，可用于驗(yàn)證circRNA的剪接、miRNA海綿和翻譯的功能。在驗(yàn)證翻譯型circRNA時(shí)，也可通過(guò)加入相應(yīng)的標(biāo)簽驗(yàn)證circRNA肽和蛋白或RNA之間的互作關(guān)系。此外，也可以通過(guò)設(shè)計(jì)siRNA來(lái)敲低目的circRNA，用于驗(yàn)證circRNA的部分生物學(xué)功能。

circRNA的應(yīng)用研究

circRNA因其環(huán)化結(jié)構(gòu)具有較高的穩(wěn)定性，在各種組織和體液中含量豐富，且被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌和肝癌等發(fā)生有關(guān)[66]。豐富的circRNA表達(dá)譜以及其高穩(wěn)定性使得circRNA可能開發(fā)為疾病監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA表達(dá)改變影響腫瘤發(fā)生進(jìn)程[67-68]，因此circRNA有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

前列腺癌2018年Xia等[69]通過(guò)SBC-ceRNA芯片對(duì)4對(duì)前列腺腫瘤和癌旁組織中差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)了1021個(gè)差異表達(dá)的circRNA，采用qPCR驗(yàn)證確定了hsa_circ_0057558和hsa_circ_0062019的表達(dá)。此外他們還發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)circRNA調(diào)控miR-5008的表達(dá)，且hsa_circ_0057558、hsa_circ_0062019及其母基因均為前列腺癌的潛在生物標(biāo)志物。

circABCC4在前列腺癌的腫瘤組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，并通過(guò)吸附調(diào)控miR-1182促進(jìn)叉頭蛋白4(forkhead box P4，F(xiàn)OXP4)在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。沉默circABCC4能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移和侵襲。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了circABCC4的沉默延緩腫瘤的生長(zhǎng)。研究結(jié)果支持circABCC4通過(guò)miRNA海綿功能促進(jìn)FOXP4的表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌的惡性行為[70]。在此研究基礎(chǔ)上有望開發(fā)依據(jù)circABCC4-miR-1182-FOXP4調(diào)控回路的干預(yù)前列腺癌的方法。

乳腺癌circUBAP2在三陰性乳腺癌中被顯著上調(diào)。circUBAP2的高表達(dá)與腫瘤增大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后等密切相關(guān)。circUBAP2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，吸附miR-661上調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis-associated protein 1，MTA1)的表達(dá)。通過(guò)沉默miRNA-661或過(guò)表達(dá)MTA1可逆轉(zhuǎn)由circUBAP2干擾引起的惡性腫瘤發(fā)生。該研究表明circUBAP2通過(guò)調(diào)控miR-661/MTA1影響三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為三陰性乳腺癌的治療靶點(diǎn)[71]。

另一個(gè)潛在的三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)是circKIF4A。circKIF4A表達(dá)上調(diào)與三陰性乳腺癌進(jìn)展相關(guān)，circKIF4A能吸附miR-375，抑制驅(qū)動(dòng)蛋白4A(kinesin family member 4A，KIF4A)的表達(dá)以減緩三陰性乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，circKIF4A是三陰性乳腺癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)[72]。

肺癌Yao等[73]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_100876在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，circRNA_100876高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者總生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者，其表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，circRNA_100876可能是非小細(xì)胞肺癌一個(gè)新的預(yù)后標(biāo)志物和診斷治療靶點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療非常有幫助。

Hsa_circRNA_103809/miR-4302/ZNF121/MYC是一種在肺癌中起作用的新型通路，hsa_circRNA_103809在肺癌組織中高表達(dá)。通過(guò)敲除該circRNA分子能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的體外增殖和侵襲，延緩腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。Hsa_circRNA_103809作為miR-4302的海綿，靶向并促進(jìn)鋅指蛋白121(zinc finger protein 121，ZNF121)的表達(dá)，可以作為肺癌患者的預(yù)后標(biāo)志物[74]。

胃癌Zhang等[75]研究了circRNA_100269及其下游miRNA靶點(diǎn)的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRNA_100269在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，所對(duì)應(yīng)的miR-630表達(dá)上調(diào)，證明它們之間產(chǎn)生互作，circRNA_100269能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果揭示了一種新的參與胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路，有望成為腫瘤診斷標(biāo)記物。

Hsa_circ_0003159在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與胃癌患者主要臨床病理因素有關(guān)。hsa_circ_0003159在胃癌中的低表達(dá)與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和TNM分期有顯著關(guān)系，在胃癌診斷中具有潛在價(jià)值[76]。

肝癌circMTO1是一個(gè)在肝癌組織中顯著下調(diào)的circRNA，且circMTO1低表達(dá)的肝癌患者生存期縮短，肝癌細(xì)胞中circMTO1的沉默可以下調(diào)癌基因miR-9的靶點(diǎn)p21，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，且miR-9抑制劑可阻斷circMTO1沉默對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用。因此circMTO1可能是肝癌治療的潛在靶點(diǎn)，肝癌組織中circMTO1的降低也可作為預(yù)后不良的預(yù)測(cè)指標(biāo)[77]。

Qin等[78]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001649在肝癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小有關(guān)。當(dāng)hsa_circ_0001649被敲除后，對(duì)促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用的基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase，MMP)9、MMP10和MMP13的mRNA水平顯著升高，hsa_circ_0001649可能在肝癌的轉(zhuǎn)移中起作用。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，hsa_circ_0001649可能作為一種新的肝癌生物標(biāo)記物，具有較高的準(zhǔn)確性、特異性和敏感性。

展 望

circRNA穩(wěn)定性高、表達(dá)豐富、功能多樣，近年來(lái)開始引起研究者的關(guān)注，但目前對(duì)于circRNA的研究處于起始階段。近年來(lái)對(duì)于circRNA的研究主要集中在其miRNA海綿功能上，研究者通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)circRNA與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，利用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)以捕獲miRNA，AGO2免疫共沉淀也可以進(jìn)一步研究miRNA調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，circRNA和miRNA在細(xì)胞中的共定位可以利用FISH技術(shù)來(lái)驗(yàn)證，目前這些成熟的實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了circRNA的miRNA海綿功能，使整個(gè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)更加完整和復(fù)雜。

現(xiàn)在對(duì)于circRNA生成機(jī)制的研究也越來(lái)越多，RBP除了可以與circRNA結(jié)合降低RBP對(duì)靶基因的調(diào)控，影響腫瘤的發(fā)生[79]，部分RBP還能夠調(diào)控circRNA的生成，對(duì)于腫瘤的發(fā)展也產(chǎn)生了重要作用[80]。但現(xiàn)在對(duì)于能夠直接揭示circRNA與蛋白質(zhì)互作機(jī)制的實(shí)驗(yàn)技術(shù)還十分有限，需要進(jìn)一步探索。circRNA的翻譯功能也逐漸成為了熱點(diǎn)，circRNA的翻譯起始機(jī)制主要有帽子依賴的、IRES依賴的、m6A依賴的和小ORF(small ORF，sORF)依賴的翻譯起始[81]，circRNA編碼的蛋白具有抑制腫瘤活性、保護(hù)蛋白不受降解等功能[82]。綜上，circRNA和蛋白之間的互作以及它的翻譯功能對(duì)于腫瘤的研究有著重要意義，未來(lái)應(yīng)對(duì)這方面進(jìn)行更深入的研究。

circRNA穩(wěn)定性高，在各種組織和體液中廣泛表達(dá)，因此可作為潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。研究表明circRNA在外泌體中含量豐富且穩(wěn)定，有些circRNA在血液中的表達(dá)量比組織中更高[83]，circRNA在體液中的高表達(dá)及高穩(wěn)定性將更有利于其臨床應(yīng)用。然而盡管RNA-seq鑒定出數(shù)千種組織和疾病特異的circRNA，但現(xiàn)階段對(duì)于circRNA的生成機(jī)制和生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)還十分有限。