GPR30激活后下調(diào)P53-PUMA信號抑制全腦缺血誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元線粒體凋亡途徑

郭思含，孫立萍，趙雨逢，韓 東，王瑞敏，胡書群

0 引 言

全腦缺血導(dǎo)致的認知功能障礙是心臟驟停(cardiac arrest，CA)生存者最普遍的后遺癥。大鼠四動脈結(jié)扎全腦缺血(global cerebral ischemia，GCI)模型可模擬心臟驟停誘發(fā)的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡[1]。目前，亞低溫治療是治療CA的唯一措施，進一步研究發(fā)現(xiàn)溫度降低時冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白表達顯著增強，可有效保護CA大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷[2]。然而，Meta分析顯示，亞低溫治療并不能有效改善CA幸存者認知功能[3]，亟待探求其所致神經(jīng)元損傷的機制和有效的治療措施。

近期，雌激素膜受體--G蛋白耦聯(lián)雌激素受體30(G Protein-coupled Estrogen Receptor 30，GPER/GPR30)的神經(jīng)保護作用受到了研究者關(guān)注。GPR30特異激動劑G1具有類雌激素活性。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，皮下埋置60 μg/d G1緩釋泵30 d可顯著降低腦卒中小鼠腦梗死體積，改善中風誘導(dǎo)的外圍免疫抑制，并且未發(fā)現(xiàn)G1引起血壓、血氣、血糖等生理指標變化，也未發(fā)現(xiàn)引起血清雌激素水平升高、子宮肥大、乳腺細胞增殖等副作用。G36是最新發(fā)現(xiàn)的GPR30特異拮抗劑，在結(jié)構(gòu)上G36與G1極其相似；與較早發(fā)現(xiàn)的GPR30拮抗劑G15相比，G36對GPR30具有更高的選擇性，且與雌激素受體(estrogen receptor, ER)α/β具有更低的親和力，同時G36可降低雌激素應(yīng)答元件(estrogen response elements，EREs)的激活[5]。最近，采用GPR30特異激動劑、拮抗劑作為工具藥，證實了GPR30激活具有抗神經(jīng)炎癥和抗凋亡作用[6-8]。然而，其具體機制尚不清楚。

P53是一種腫瘤抑制蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，同時P53也可作為一種凋亡調(diào)控蛋白，對誘導(dǎo)細胞凋亡起重要作用。在正常細胞中，P53被一系列調(diào)節(jié)因子維持在較低水平。其中，小鼠雙微體2(murine double minute 2，MDM2)基因作為P53的泛素連接酶，通過泛素化作用促進P53降解[9]。但是，在多種應(yīng)激刺激如缺血/缺氧、DNA損傷、氧化應(yīng)激等情況下，P53蛋白被磷酸化激活，從而阻斷P53與MDM2的結(jié)合和降解，導(dǎo)致P53穩(wěn)定性增強[10-11]。關(guān)于P53促凋亡作用的分子機制，目前有研究認為一是P53轉(zhuǎn)錄依賴的細胞核機制，通過促進P21等靶基因蛋白表達促進凋亡；另一是非轉(zhuǎn)錄依賴的線粒體機制，即P53直接轉(zhuǎn)位出核，促進線粒體凋亡途徑[12]。P53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(P53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA)是P53的一個重要靶基因，屬于含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl2家族成員，可通過P53的轉(zhuǎn)錄依賴和非轉(zhuǎn)錄依賴途徑促進細胞凋亡[13]。

在小鼠脊髓損傷模型，GPR30激活可增加抗凋亡蛋白Bcl2水平、下調(diào)促凋亡Bax蛋白水平，從而阻斷線粒體凋亡途徑[14-15]。然而，在大鼠GCI模型，GPR30激活的抗凋亡作用是否與P53信號介導(dǎo)的線粒體凋亡通路有關(guān)，尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物及主要試劑SPF級成年雌性SD大鼠，3～4月齡，體重250～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，試驗動物合格證號：SCXK(京)2014-0004。所有實驗動物均在SPF級飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲食，室溫22～24 ℃。

抗PUMAα/β(sc-28226)、抗Bcl2(sc-7382)、抗GAPDH(sc-32233)一抗購自Santa Cruz公司；抗p-P53(Ser15, ab1431)、抗P53(Ab26)一抗購自abcam公司；抗NeuN(MAB377)一抗購自Millipore公司；抗actin(A2066)一抗購自Sigma-Aldrich公司；Alexa-Fluor 488/568熒光二抗購自Invitrogen公司。TUNEL檢測試劑盒(LOT #1639496，Life technologies)購自Active Motif公司；G1(Cat. No.3577/10)、G36(Cat. No.4759)和 Pifi-α(Cat. No. 1267)購自Tocris公司。

1.2方法

1.2.1 實驗動物分組與模型制備研究報道，在GCI模型中，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷出現(xiàn)在24～72 h[1]。因此，本研究選擇缺血再灌注7d時間點觀察P53信號、GPR30受體激活對缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)生存的影響；選擇再灌注1、3 d時間點揭示其可能的分子機制。 具體分組及實施方案如下：實驗分組：所有大鼠禁食12 h，均行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)，并隨機分為以下9組：假手術(shù)組(Sham組)：只暴露雙側(cè)椎動脈和雙側(cè)頸總動脈，不進行電凝和夾閉；缺血再灌注1、3、7 d組(I/R 1d/3d/7d組)：缺血12 min，再灌注1、3、7 d；缺血再灌注1、3 d+G1組(I/R 1d/3d+G1組)：G1(10 μg/d)于卵巢切除同時頸部皮下埋植微量釋放泵，1周后制備缺血再灌注模型，方法同第②組；缺血再灌注3、7d+ Pifi-α組(I/R3d/7d+ Pifi-α組)：Pifi-α在缺血前20 min側(cè)腦室微量注射10 μg，連續(xù)給藥3 d，缺血再灌注方法同第②組；缺血再灌注7 d+G36+Pifi-α處理組(I/R 7 d+G36+ Pifi-α組)：G36給藥與第⑤組G1給藥進行相同操作，G36劑量為(10 μg/d)，Pifi-α與缺血再灌注方法同第⑧組2)GCI模型制備OVX術(shù)后7 d制備GCI模型[5]。手術(shù)第1天，永久性電凝大鼠椎動脈，同時分離雙側(cè)頸總動脈，用手術(shù)縫合線做標記。24 h后，再次暴露雙側(cè)頸總動脈，用動脈夾夾閉12 min，再灌注1、3和7 d。缺血過程中采用加熱墊維持大鼠肛溫維持在36.5～37.5 ℃。缺血成功的標志為：大鼠在缺血后30～60 s內(nèi)失去活動能力，翻正反射消失，雙側(cè)瞳孔散大，對光刺激閉瞼反射消失，眼球顏色由鮮紅色變成灰白色，四肢僵直。符合以上標準的大鼠用于本研究。

1.2.2海馬冠狀冰凍切片的制備及免疫組化參照本實驗室已建立的實驗方法[5]，分別于所需時間點處死大鼠，快速取腦，分離海馬CA1區(qū)，一半大腦凍存于液氮中，用于Western blot分析；另一半大腦置于4%的多聚甲醛溶液中固定，4 ℃過夜，次日，將固定好的腦塊置于30%的蔗糖溶液中脫水，4 ℃儲存，至脫水完全。將腦組織用OCT包埋，迅速置于-80 ℃冰箱中速凍，在-20 ℃制備連續(xù)冠狀冰凍切片(25 μm)，-20 ℃儲存腦片、備用。

腦組織冠狀切片用0.1 mol/L PBS洗滌10 min×3次，0.4%TritionX-100-PBS打孔2 h，10%驢血清室溫封閉1 h。一抗孵育4 ℃過夜；用0.1%TritionX-100-PBS洗滌10 min×3次。加相應(yīng)的熒光二抗(1∶250)，室溫避光孵育2h。0.1%Trition-PBS洗滌3次，每次15 min。DAPI封片劑封固。采用Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3TUNEL原位細胞凋亡檢測技術(shù)缺血/再灌注7 d大鼠的腦冠狀冰凍切片用于TUNEL原位細胞凋亡實驗。實驗步驟如下：冰凍切片用0.1 mol/L PBS洗滌10 min×3次。NeuN免疫組化結(jié)束后，參照TUNEL試劑盒說明書，將切片置于反應(yīng)緩沖液A中孵育10 min。在含有酶溶液的TdT反應(yīng)混合物中，37 ℃恒溫箱孵育1 h。dH2O洗滌5 min。在Click-iT Plus TUNEL反應(yīng)混合物中，37 ℃恒溫箱孵育30 min。0.1%Triton-100-PBS洗滌20 min。甘油-PBS封固，激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)下捕獲圖像，并使用數(shù)字成像軟件(FV10-ASW1.5)進行分析。

1.2.4Western blot方法按照本實驗室已建立的實驗方法[3]，制備各組海馬CA1區(qū)組織勻漿液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度。將配平好的蛋白樣品加入5×上樣緩沖液處理，沸水浴中煮5 min使蛋白充分變性。采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標蛋白，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，3%的牛血清白蛋白中封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，孵育4 ℃過夜，TBST洗膜5 min×3次，孵育相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗1 h。TBST洗膜10 min×3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，圖像采集儀器掃描。

2 結(jié) 果

2.1 GPR30特異拮抗劑G36逆轉(zhuǎn)Pifi-α的神經(jīng)保護作用激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，I/R 7d組海馬CA1區(qū)NeuN陽性染色細胞數(shù)量較假手術(shù)組減少(P<0.01)，但TUNEL的陽性細胞數(shù)量增多(P<0.01)。與I/R 7d組相比，Pifi-α處理組海馬CA1區(qū)NeuN陽性細胞數(shù)增加(P<0.01)，而TUNEL陽性細胞數(shù)減少(P<0.01)。與單純給予Pifi-α組相比，GPR30特異拮抗劑G36聯(lián)合Pifi-α處理組海馬CA1區(qū)NeuN陽性細胞數(shù)量減少(P<0.01)，而TUNEL陽性細胞數(shù)增加(P<0.01)。見圖1，表1。

a：假手術(shù)組；b：I/R 7d組；c：I/R 7d+Pifi-α組；d：I/R 7d+Pifi-α+G36組圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)TUNEL技術(shù)(紅色)和NeuN免疫熒光染色代表性圖Figure 1 Representative photographsof TUNEL analysis(red)and IF staining for NeuN (green)

表1 生存神經(jīng)元和凋亡細胞數(shù)量Table 1 The numbers of survival neurons and TUNEL cells

2.2GPR30特異激活劑G1抑制大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)P53磷酸化Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，GCI后1、3d海馬CA1區(qū)P53磷酸化水平均升高(P<0.05)。與缺血/再灌注相應(yīng)時間點(1、3d)相比，用G1激活GPR30受體降低了缺血/再灌注誘導(dǎo)的P53磷酸化水平(P<0.05)，見圖2。與假手術(shù)組相比，缺血再灌注3d組海馬CA1區(qū)p-P53免疫熒光強度增強，且與DAPI熒光共定位，而G1處理組類似于假手術(shù)組，顯示海馬CA1區(qū)p-P53免疫熒光強度較I/R 3d組降低。見圖3。

1：假手術(shù)組； 2：I/R 1d組； 3：I/R 1d+G1組； 4：I/R 3d組； 5：I/R 3d+G1組a:Western blot檢測； b:半定量分析與假手術(shù)組比較，*P<0.05圖2 GPR30特異激動劑G1降低海馬CA1區(qū)GCI誘導(dǎo)的P53磷酸化激活Figure 2 GPR30 agonist G1attenuated P53 phosphorylation (activation) induced by GCI in the hippocampal CA1 region

a：假手術(shù)組; b：I/R 3d組; c：I/R 3d+G1組DAPI(藍色)熒光顯示細胞核陽性染色圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)p-P53(紅色)免疫熒光染色Figure 3 Immunofluorescence staining of p-P53(red)in the hippocampal CA1 region of the rats

2.3GPR30影響P53的初步分子機制研究Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，GCI后 1、3d海馬CA1區(qū)PUMA蛋白水平升高(P<0.05)，同時Bcl2蛋白水平降低(P<0.05);給予G1處理抑制了缺血 再灌注誘導(dǎo)的PUMA蛋白水平(P<0.05)，反而提高了Bcl2的蛋白水平(P<0.05);并且G1處理組Bcl2蛋白水平高于假手術(shù)組對照組(P<0.05)。見圖4。與假手術(shù)組相比，I/R 3d組海馬CA1區(qū)PUMA和GFAP熒光強度均增強，且呈現(xiàn)明顯的PUMA與GFAP共定位(黃色);而給予G1處理PUMA與GFAP的免疫 熒光強度均較I/R 3d 組降低。Bcl2的免疫熒光強度與PUMA的變化相反，顯示I/R 3d組海馬CA1區(qū)Bcl2熒光強度較假手術(shù)組降低，而G1處理升高了Bcl2的免疫熒光強度。見圖5。

1：假手術(shù)組; 2：I/R 3d組; 3：I/R 3d+Pifi-α組a：Western blot檢測；b：PUMA蛋白半定量分析；c：Bcl2蛋白半定量分析與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與I/R 3d組比較，#P<0.05圖4 P53特異抑制劑Pifi-α對GCI后海馬CA1區(qū)PUMA和Bcl2蛋白水平的影響Figure 4 Effects of P53 specific inhibitorPifi-α on protein levelsof PUMA and Bcl2 in the hippocampus CA1 region after GCI

2.4GPR30激活減少大鼠全腦缺血后海馬CA1區(qū)PUMA的蛋白水平、增加Bcl2蛋白水平Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，GCI后1、3d海馬CA1區(qū)PUMA蛋白水平升高(P<0.05)，同時Bcl2蛋白水平降低(P<0.05)；給予G1處理抑制了缺血再灌注誘導(dǎo)的PUMA蛋白水平(P<0.05)，反而提高了Bcl2的蛋白水平(P<0.05)；并且G1處理組Bcl2蛋白水平高于假手術(shù)組對照組(P<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，I/R 3d組海馬CA1區(qū)PUMA和GFAP熒光強度均增強，且呈現(xiàn)明顯的PUMA與GFAP共定位(黃色)；而給予G1處理PUMA與GFAP的免疫熒光強度均較I/R 3d組降低。Bcl2的免疫熒光強度與PUMA的變化相反，顯示I/R 3d組海馬CA1區(qū)Bcl2熒光強度較假手術(shù)組降低，而G1處理升高了Bcl2的免疫熒光強度。見圖6。

1：假手術(shù)組； 2：I/R 1d組； 3：I/R 1d+G1組； 4：I/R 3d組； 5：I/R 3d+G1組a:Western blot檢測； b:GAPDH半定量分析; c:Bcl2半定量分析與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與I/R 1d組比較，#P<0.05; 與I/R 3d組比較，△P<0.05圖5 GPR30特異激動劑G1對GCI后海馬CA1區(qū)PUMA、Bcl2蛋白水平的影響Figure 5 Effects of GPR30 agonist G1 on PUMA and Bcl2 protein levels in the hippocampus CA1 region after GCI

圖6 電鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)PUMA和GFAP以及Bcl2的表達(IHS)Figure 6 Representative images of Immunofluorescence staining for PUMA and GFAP, as well as BCL2 in the Hippocampal CA 1 region in the indicated groups (IHS)

3 討 論

課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體調(diào)節(jié)劑如17β雌二醇、G1均可誘導(dǎo)雌激素膜受體GPR30激活，從而降低腦損傷后神經(jīng)元凋亡，其分子機制與快速上調(diào)AKT、ERK促生存信號通路和抑制神經(jīng)炎癥損傷密切相關(guān)[6,16-17]。本研究采用大鼠GCI模型，進一步研究說明GPR30激活的神經(jīng)保護作用可能與抑制P53-PUMA/Bcl2凋亡信號通路相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)P53特異抑制劑Pifi-α可有效降低I/R 7d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，而GPR30特異拮抗劑G36阻斷了Pifi-α的此神經(jīng)保護作用。

結(jié)果提示，轉(zhuǎn)錄因子P53可能與GPR30介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用相關(guān)。為進一步驗證此結(jié)論，課題組觀察了GPR30激動劑G1對P53磷酸化(激活)和蛋白水平的影響。Western blot及免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注1d和3d，海馬CA1區(qū)P53磷酸化水平較假手術(shù)組控制組顯著升高；G1處理降低了GCI誘導(dǎo)的P53磷酸化激活；且p-P53蛋白主要定位在細胞核；P53蛋白水平在各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。P53為調(diào)控細胞凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子，對氧化應(yīng)激、DNA損傷極為敏感，其穩(wěn)定和活性在細胞凋亡中至關(guān)重要。在GCI模型，P53敲除可降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡[18]。缺血預(yù)處理是激發(fā)機體內(nèi)源性保護機制的重要措施；最近研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)處理可降低再灌注1d和2d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞核中p-P53水平[19]。Vecino等[20]也發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)、外缺血預(yù)處理模型，海馬神經(jīng)元中泛素E3連接酶MDM2蛋白水平升高，從而促進P53泛素化降解和P53的磷酸化激活，促進其細胞核輸出，降低神經(jīng)元損傷。腦外傷后5h給予大鼠Pifi-α可顯著降低海馬CA1區(qū)和DG區(qū)P53蛋白水平，降低神經(jīng)元損傷，改善認知功能[13]。已有研究證明，P53在Ser15位點磷酸化會損傷其與MDM2的結(jié)合，從而增加P53的穩(wěn)定和積累[21]。說明MDM2蛋白也是P53蛋白穩(wěn)定的重要調(diào)控靶點。雌激素受體α激動劑PPT可上調(diào)MDM2蛋白水平，改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認知功能[22]?；谝陨衔墨I報道，本研究結(jié)果說明，在大鼠GCI模型，GPR30的抗凋亡作用與P53蛋白的穩(wěn)定與激活密切相相關(guān)。

研究證明，P53可通過其轉(zhuǎn)錄和/或非轉(zhuǎn)錄依賴的信號通路促進細胞凋亡，兩條均通過調(diào)控線粒體Bcl2家族成員誘導(dǎo)細胞凋亡[23]。P53轉(zhuǎn)錄激活可促進其下游靶基因PUMA、Bax、Noxa等促凋亡蛋白表達；而P53非轉(zhuǎn)錄依賴通路多為P53轉(zhuǎn)位到細胞漿或線粒體干擾Bax與抗凋亡蛋白Bcl-xL結(jié)合，直接誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑。為進一步揭示P53信號在GPR30神經(jīng)保護作用機制，課題組首先檢測了G1對PUMA、抗凋亡蛋白Bcl2表達的影響。結(jié)果顯示，G1降低了海馬CA1區(qū)GCI誘導(dǎo)的PUMA水平，同時增加了Bcl2蛋白水平，并且Bcl2蛋白水平顯著高于假手術(shù)組對照組；提示G1處理不但起到神經(jīng)保護作用，而且可激活抗凋亡信號通路；這與我們以往的研究一致，研究發(fā)現(xiàn)用G1激活GPR30可上調(diào)AKT、ERK促生存信號通路[17]。另外，免疫組化結(jié)果顯示，PUMA主要定位在細胞核，且在I/R 3d組的海馬CA1區(qū)可見PUMA與星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP共定位，提示PUMA也可能參與缺血后膠質(zhì)細胞激活和損傷的調(diào)控。進一步研究發(fā)現(xiàn)，P53特異抑制劑Pifi-α的影響同G1的作用，均可顯著降低GCI后海馬CA1區(qū)PUMA蛋白水平，同時增加了Bcl2水平。研究結(jié)果進一步說明，GPR30激活可能通過抑制P53轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl2表達，同時抑制了促凋亡蛋白PUMA蛋白水平；當然，不能排除G1通過AKT等快速信號通路直接抑制Bcl2依賴的線粒體凋亡。與本研究結(jié)果一致，在小鼠抗氧化酶5基因沉默模型中，線粒體解偶聯(lián)劑魚藤酮通過增加P53磷酸化激活，上調(diào)PUMA了蛋白水平，從而增加膽堿能神經(jīng)元凋亡[25]。Pifi-α是P53活性抑制劑，可逆性抑制P53依賴的轉(zhuǎn)錄活性。在腦卒中、腦外傷動物模型，Pifi-α可抑制P53下游促凋亡靶基因PUMA、BAX等蛋白表達，從而降低神經(jīng)元損傷[13,27]。

GPR30為雌激素膜受體，課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，在GCI模型，結(jié)合雌激素EDC和E2-BSA可通過GPR30激活介導(dǎo)AKT、ERK1/2快速促生存信號通路[28]；另外，用G1激活GPR30也可通過上調(diào)IL1RA蛋白表達降低神經(jīng)炎癥損傷[5]。也有文獻報道，GPR30在細胞核也有表達，激活抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信號通路[29]。那么，GPR30介導(dǎo)的非基因和/或基因信號通路如何調(diào)控P53-PUMA信號，其精確的分子機制尚有待進一步研究。